зі зміненим ізотопним складом на стан ДНК лімфоцитів
Для вивчення впливу води з пониженим вмістом дейтерію на життєздатність імунокомпетентних клітин in vitro, лімфоцити, ізольовані з крові здорових донорів та хворих з ВПР ЧЛО, инкубировались в фізрозчин, приготованих на воді з природним вмістом дейтерію (вміст D 150 ± 2 ppm) і на воді зі зміненим ізотопним складом (вміст D 40 ± 2 ppm). Після лізірованіе клітин і відповідної обробки розчинів отримані спектри флюоресценції.
Малюнок 4 - Інтенсивність флюоресценції розчину бромистого етидію з Лізат лімфоцитів крові здорових донорів. (Інкубування в фізрозчин, приготованих на звичайній дистильованій воді (вміст D 150 ppm) і воді зі зміненим ізотопним складом (вміст D 40 ppm). Час інкубування 16 годину, t=24 0С.)
На малюнку 4 представлені зняті спектри флюоресценції для здорових донорів. При замочуванні в физрастворе на звичайній і легкій воді величина флюоресценції від фону не відрізняється, що говорить про відсутність однониткових розривів ДНК лімфоцитів.
На малюнку 5 представлені зняті спектри флюоресценції для хворих з ВПР ЧЛО донорів, ДНК яких має безліч розривів. З малюнка видно, що при інкубації лімфоцитів физрастворе на легкій воді флюоресценція зразків вище, т. Е. Кількість однониткових розривів менше, ніж при інкубації в физрастворе на звичайній воді.
Таким чином, в ході виконання експерименту показано, що вода зі зниженим вмістом дейтерію є або інгібітором апоптозу імунокомпетентних клітин, або активує їх ДНК-репаруючу системи.
Малюнок 5 - Інтенсивність флюоресценції розчину бромистого етидію з Лізат лімфоцитів крові хворих з ВПР ЩЛД. (Інкубування в фізрозчин, приготованих на звичайній дистильованій воді (вміст D 150 ppm) і воді зі зміненим ізотопним складом (вміст D 40 ppm). Час інкубування 16 годину, t=24 0С.)
Для з'ясування даного припущення були проведені експерименти з використанням рекомбінантного людського фактора некрозу пухлин hTNF ?. Як відомо [36], hTNF? є протизапальним цитокіном, який ініціює апоптоз як у лімфоцитах, так і в нейтрофілах. В експериментах в середовищі створювалася концентрація hTNF ?, рівна 10 нг/мл, яка гарантовано ініціює апоптоз лімфоцитів. Клітини, виділені з крові здорових донорів, инкубировались в физрастворе, приготованому на воді з пониженим вмістом дейтерію, у присутності hTNF? при кімнатній температурі. Для контролю лімфоцити инкубировались в физрастворе, приготованому на звичайній дистильованій воді, також у присутності і у відсутності hTNF ?. Після закінчення часу інкубації проводили вимірювання кількості однониткових розривів ДНК. На малюнку 6 наведені відповідні спектри флюоресценції розчинів лизатов клітин з бромистим етидієм. З малюнка видно, що при використанні звичайної води дію фактора некрозу hTNF? призводить до прогресивного накопиченню однониткових розривів ДНК в клітинах - інтенсивні флюоресценції знижувалася. При замочуванні на легкій воді розривів ДНК не з'являлося, що говорить захищає дію легкої води.
Малюнок 6 - Інтенсивність флюоресценції розчину бромистого етидію з Лізат лімфоцитів крові здорових донорів. (Інкубування в фізрозчин з 10 нг/мл hTNF ?, приготованих на звичайній дистильованій воді (вміст D 150 ppm) і воді зі зміненим ізотопним складом (вміст D 40 ppm). Час інкубування 16 годину, t=24 0С.)
На малюнку 7 представлена ??діаграма процентного вмісту однониткових розривів ДНК в нормі, при додаванні чинника некрозу і хворих з ВПР ЧЛО при інкубації в фізіологічному розчині на легкій і звичайній воді. Виявлено, що інкубація лімфоцитів хворих донорів у физрастворе, приготованому на воді з вмістом дейтерію 40 ppm за 16 годин зменшує кількість однониткових розривів ДНК порівняно з контролем з 59 - 62% до 36 - 40%. Збільшення часу інкубування до 24 год істотно не впливало на отримані значення.
Малюнок 7 - Вплив води зі зміненим ізотопним складом на кількість однониткових розривів лімфоцитів в нормі, з додаванням в інкубаційного середовища 10 нг/мл hTNF? і у хворих ВПР ЩЛД. (Інкубування в фізрозчин, приготованих на звичайній дистильованій воді (вміст D 150 ppm) і воді зі зміненим ізотопним складом (вміст D 40 ppm). Час інкубування 16 годину, t=24 0С.)
При аналогічній обробці лімфоцитів, отриманих з крові здорових донорів, кількість однониткових розривів ДНК було істотно менше, мало залежало від середовища інкубування і становило 2,5 ± 0,2%. Це свідчить, про те, ДНК лімфоцитів здорових донорів менш схильні до пошкоджень в порівнянні з ДНК лімфоцитів хворих з ВПР ЧЛО, в яких спостерігаються мутації генів.
При інкубуванні лімфоцитів здорових донорів з додаванням фактора некрозу пухлини в физрастворе на звичайній воді, кількість розривів ДНК збільшувалася з 2,5 ± 0,2% до 23 - 25%, а при замочуванні на легкій воді, однониткових розривів не спостерігалося.
При вико...
