етерофазна розчин. На дно випадав осад червоного кольору з еритроцитів і тромбоцитів, т. К. Їх щільність вище щільності фіколла-урографіну. Надосадова рідина розділилася на дві фази: прозора - фіколл-урографін і червона рідина, що є плазму крові. На межі розділу цих двох фаз утворилося кільце з біло-жовтих згустків, що містить лімфоцити. За допомогою Мікродозатори проводився збір міжфазного кільця, вміст якого було поміщено в окремий стерильний Еппендорф для подальшої відмивання клітин від домішок. Для відмивання клітин був доданий фізрозчин в кількості 500 мкл, а потім Еппендорфа знову були поміщені в центрифугу на 10 хв зі швидкістю обертання 400 об/хв. Після цього відбирали надосадову рідину. Виділені лімфоцити цільної крові можна зберігати при температурі мінус 20 0С. На малюнку 2 представлена ??фотографія виділених лімфоцитів.
Малюнок 2 - Фотографія виділених лімфоцитів, зроблена на оптичному мікроскопі БІОМЕД - 6 Вар 3 при збільшенні 1: 1000
2.3 Інкубування лімфоцитів у воді зі зміненим ізотопним складом і визначення однониткових розривів ДНК
Лімфоцити, ізольовані з крові, инкубировались протягом 16 годин при кімнатній температурі у фізіологічному розчині, приготованому на воді з пониженим вмістом дейтерію (40 ± 2 ppm) і звичайній воді (150 ± 2ppm). Це необхідно для того, що б з'ясувати, як впливає легка вода на життєздатність клітин in vitro. Для з'ясування впливу часу інкубування на життєздатність лифоцитов, останні вимочувалися в физрастворе, приготованому на легкій воді протягом 3, 8, 16, 24 годин. Проведені експерименти показали, що при часі інкубування 16 годин спостерігалася найвища ефективність репарації ДНК.
Для інкубування дві проби лімфоцитів, виділених з крові здорових і хворих ВПР ЧЛО донорів, замочували в 1 мл фізіологічного розчину на легкій воді, а дві інші аналогічні проби замочували у фізіологічному розчині на звичайній воді.
Для лізірованіе клітин був приготований 4,5м розчин сечовини. Сечовина є детергентом, використовується в біологічних і біохімічних лабораторіях, являє собою м'який реагент, який використовуються для руйнування мембрани клітин (лізису клітин) і трансформації внутрішньоклітинного матеріалу в розчинну форму. Детергенти використовуються в основному для руйнування міжбілкового, білково-ліпідних і межліпідних зв'язків, денатурації білкових структур, запобігання неспецифічного зв'язування в імунохімічних аналізах і кристалізації білків. Після інкубування в усі проби було додано по 0,2 мл 4,5м розчину сечовини. Клітини ціалізуватися протягом 10 хв при кімнатній температурі. У цьому випадку відбувається руйнування оболонки лімфоцитів, тим самому вивільнення молекули ДНК.
Лізати клітин в експериментальних зразках піддавалися лужній обробці протягом 30 хв при 0 0С, а потім 60 хвилин при 15 0С. Для цього в усі проби додавалося по 0,2 мл 0,1% HCl. Далі зразки піддавалися інтенсивному струшуванні на Вортекс. Цим досягалося розплітання молекул ДНК.
Після лужної обробки лизатов в зразки додавався розчин бромистого етидію. Ця хімічна речовина з групи фенантрідінов (3,8-діаміно - 6-етил - 5-фенілфенантрідіумбромід), широко застосовується для флуорісцентной маркування ДНК. При опроміненні бромистий етидієм флюоресцирует помаранчевим кольором. Є інтеркалірующім агентом, т. Е. Речовиною, здатною вбудовуватися між основами ДНК, його Інтеркаляція супроводжується розкручуванням суперспіралізованних ділянок ДНК. Використовується в якості барвника для детектування дволанцюжкових молекул ДНК і РНК.
Інтенсивність флюоресценції отриманих зразків визначалася на Спектрофлуориметр Флюорат - 02-Панорама в діапазоні довжин хвиль 540-740нм.
Кількість однониткових розривів ДНК оцінювалося по відношенню величин флюоресценції контрольних і експериментальних зразків. Для зняття фонової флуорисценцией підготували зразок, що містить всі компоненти як у експериментальних зразках і в тій же концентрації, але без молекул ДНК. Розміщуємо зразок у кюветноє відділення. На комп'ютері відкриваємо програму «Панорама», в ній вибираємо режим флуориметрії. Потім задаємо довжину хвилі збудження - 540 нм, спектральний діапазон реєстрації 540-740 нм. Далі натискаємо кнопку старт. Вимірювання флуоресценції в даному діапазоні йде близько 2 хвилин для кожного зразка. Отримані графіки експортуємо безпосередньо в електронну таблицю Excel для подальшого аналізу результатів.
У ряді експериментів використовувався рекомбінантний людський фактор некрозу пухлини hTNF?. При замочуванні лімфоцитів здорових донорів у фізіологічному розчині на звичайній воді і воді з пониженим вмістом дейтерію в середовищі створювалася концентрація hTNF? рівна 10 нг/мл.
2.4 Вивчення впливу води...
