гують, проводять окислювальний сульфітоліз, діаліз проти 8 М сечовини, ренатурація і остаточну двостадійну хроматографію на СМ-52 целюлозі і сефадексе G-50 (RU 2054041). p> Недоліками цього способу є його відносно невисока продуктивність основних етапів процесу виділення та очищення. Особливо це відноситься до ультразвукової обробки продукту, діалізу і окислювальному сульфітолізу, що призводить до нестабільності виходу інтерферону, а також до неможливості використання цього методу для промислового виробництва інтерферону.
В якості найбільш близького аналога (прототипу) може бути вказаний спосіб отримання лейкоцитарного інтерферону людини, що полягає в культивуванні рекомбінантного штаму E.coli, заморожуванні отриманої біомаси при температурі не вище -70 В° С, розморожуванні, руйнуванні клітин мікроорганізму лізоцимом, видаленні ДНК і РНК введенням в лизат ДНК-ази та очищенням виділеної нерозчинної форми інтерферону відмиванням буферним розчином з детергентами, розчиненні осаду інтерферону в розчині гуанідин гідрохлориду, ренатурації і одностадійної очищенню іонообмінної хроматографією. В якості продуцента використовують штам E.coli SS5, отриманий за допомогою рекомбінантної плазміди pSS5, містить три промотора: Plac, Pt7 і Ptrp, і ген альфа-інтерферону з введеними нуклеотидними замінами. p> Експресія інтерферону штамом E.coli SS5, що містить цю плазміду, контролюється трьома промоторами: Plac, Pt7 і Ptrp. Рівень експресії інтерферону становить близько 800 мг на 1 л клітинної суспензії. p> Недоліком способу є низька технологічність використання ферментативного руйнування клітин, ДНК і РНК мікроорганізму і одностадійна хроматографічна очищення інтерферону. Це обумовлює нестабільність процесу виділення інтерферону, призводить до зниження його якості і обмежує можливість використання наведеної схеми для промислового виробництва інтерферону.
Недоліками даної плазміди і штаму на її основі є використання в плазміді сильного нерегульованого промотора фага Т7 в штамі Є. coli BL21 (DE3), в якому ген Т7 РНК полімерази знаходиться під промотором lac оперона і який завжди "тече". Отже, в клітці безперервно відбувається синтез інтерферону, що призводить до дисоціації плазміди і зниження життєздатності клітин штаму, і в результаті - зниження виходу інтерферону.
Для отримання великих кількостей ІФН використовують шестиденні одношарові культури клітин курячого ембріона або культивовані лейкоцити крові людини, заражені певним видом вірусу. Іншими словами, для отримання ІФН створюють певну систему вірус-клітина.
З клітки людини ізольований ген, відповідальний за біосинтез ІФН. Екзогенний людський ІФН отримують, використовуючи технологію рекомбінантних ДНК. Процедура виділення кДНК ІФН-ів полягає в наступному:
1) З лейкоцитів людини виділяють мРНК, фракционируют її за розмірами, проводять зворотну транскрипцію, вбудовують у сайт модифікованої плазміди.
2) Отриманим продуктом трансформують Є. соli; утворилися клони підрозділяють на групи, які ідентифікують. p> 3) Кожну групу клонів гібрідізіруют з ІФН - мРНК. p> 4) З утворилися гібридів, що містять кДНК і хРНК, виділяють мРНК, проводять її трансляцію в системі синтезу білка [4]. p> 5) Визначають Інтерферон противірусну активність кожної суміші, отриманої в результаті трансляції. Групи, що проявили інтерферон активність, містять клон з кДНК, гібридизувати з ІФН - мРНК; повторно ідентифікують клон, що містить повнорозмірну ІФН - кДНК людини. <В
2. Механізми дії інтерферонів
ІФН виявляють деякі види активності як лімфокіни і їм-муномодулятори. ІФН I типу, діючі переважно як інгібітори реплікації вірусів у клітині, реалізують свій ефект, стимулюючи вироблення рибосомами клітин господаря клітинних ферментів, які гальмують продукцію вірусів, порушуючи трансляцію вірусної мРНК і синтез вірусних білків.
ІФН виробляють більшість видів тварин, але прояв їх активності видоспецифічність, тобто вони діють тільки у того виду тварин, в яких виробляються.
ІФН викликають індукцію трьох ферментів:
протеїнкінази, порушує початковий етап побудови пептидного ланцюга;
олігоізоаденілат синтетази, що активує РНК-азу, яка руйнує вірусну РНК;
фосфодіестерази, руйнує кінцеві нуклеотиди тРНК, що призводить до порушення елонгації пептиду.
З урахуванням антивірусного і імуномоделюючої ефектів ІФН в НВО В«БіомедВ» запропоновані і успішно апробовані, супозиторії з ІФНаn1 та пробіотиками при терапії дисбактеріозів вірусної та бактеріальної етіології, кандидозів; в гінекологічній практиці для лікування ендометритів, клопотів, вагінітів і гінекологічного герпесу.
В
3. Терапевтичне застосування ІНФ людини
Розрізняють два покоління препаратів інтерферону. Для першого покоління характерне натуральне походження, при якому його отримують з крові донорів. З нього отримують інтерферон лейкоцитарний людський сухий, який застосовуют...
