1.Загальні принципи проточної цитометрії Метод проточної цитометрії сформувався за останні 30 років на основі окремих дослідів з підрахунку числа частинок і визначення їх розмірів. У 1965 р. з'явилося перше повідомлення про клітинному сортер, а в 70-х роках стали випускати прилади, здатні вимірювати інтенсивність флуоресценції при двох і більше довжинах хвиль і визначати відразу кілька клітинних параметрів.
В даний час випускають два основних типи приладів для проточної цитометрії: 1) прості у використанні апарати, які можуть вимірювати флуоресценцію при двох і більше довжинах хвиль і светорассеяніє під кутом близько 10 Вє (малокутове пряме розсіювання) і 90 Вє; 2) великі клітинні сортери, які не тільки вимірюють п'ять і більше клітинних або ядерних параметрів, а й сортують частки з заданим набором цих параметрів.
Принципи проточної цитометрії дуже прості. Клітини або ядра поодинці перетинають сфокусований світловий пучок, зазвичай лазерний. Світло певної довжини збуджує молекули флуоресціюючих барвників, пов'язаних з різними клітинними компонентами, при цьому при цьому може відбуватися одночасне порушення кількох різних барвників, що дозволяє оцінити відразу кілька клітинних параметрів. Світло, що випускається барвниками, збирають за допомогою системи лінз і дзеркал і розкладають на компоненти. Світлові сигнали детектируют, перетворять в електричні імпульси і далі в форму, зручну для комп'ютерної обробки і зберігання інформації.
Методом проточної цитометрії можна отримувати самі різні дані: визначати вміст у клітині ДНК і РНК, сумарна кількість білків і кількість специфічних білків, впізнаваних моноклональними антитілами, досліджувати клітинний метаболізм (наприклад, вимірювати внутрішньоклітинний рН), вивчати транспорт іонів кальцію і кінетику ферментативних реакцій (MGOrmerod, 1990). p> У продажу є різні проточні цитометрия, і викласти загальні принципи їх роботи складно. Можна відзначити лише кілька моментів, спільних для всіх приладів:
- для аналізу необхідні гомогенні суспензії ізольованих клітин;
- клітини або ядра повинні бути в достатній кількості;
- для усунення ефектів, пов'язаних з можливою агрегацією клітин, необхідно використовувати всю доступну інформацію, наприклад дані з розсіювання світла в об'ємі і відношення площі піку до його ширині. p> 2. Аналіз ДНК-гістограм
Вимірювання вмісту ДНК - одне з найпростіших і розповсюджених застосувань проточною цитометрії. Перші ДНК-гістограми, отримані в 1969 р. (MAVan Dilla, TT Trujillo, PFMullaney, JRCoulter, 1969), дозволили чітко розрізнити клітини, знаходяться в G1-, S-і G2/М-фазах клітинного циклу. З тих пір з'явилося безліч робіт з вимірювання вмісту ДНК в клінічному матеріалі, отриманому в основному від хворих на рак.
З ДНК-гістограм можна отримати два роду даних. По-перше, ідентифікувати клітини з аномальним вмістом ДНК (рис.1, Б), так звані анеупло...
