тигеном і антитілом лінія преципітації розташовується майже посередині між лунками. Кількісне переважання одного з реагентів зрушує лінію преципітації до лунки іншого реагенту. Відносна концентрація реагентів у місці первісної преципітації може зміниться, наприклад через додаткового надходження одного з них; тоді відбувається зсув фронту преципітації, але частина імунних агрегатів, особливо на стороні надлишку антитіл залишається в колишньому положенні, і їх можна виявити у вигляді вуалі або окремої зони преципітації. Можливість подібних явищ змушує при тривалій іммунодіффузіі щодня переглядати препарати.
Взаємне розташування ліній преципітації: порівняльний аналіз
Для виявлення повної або часткової ідентичності в гелі зазвичай вирізають три лунки, розташовані трикутником. У дві з низ поміщають порівнювані розчини антигенів, а в третю - антисироватки.
Якщо лінії повністю зливаються, то антигени повністю ідентичні. Якщо лінії перетинаються, то антигени не ідентичні. Якщо одна з ліній довше іншої, і виходячи з неї утворює шпору, то антигени частково ідентичні. Обидва антигену мають деякі загальні детермінанти, але у одного антигену є детермінанти, яких немає у другого, саме вони утворюють шпору. Якщо дві лінії преципітації перетинаються, частково зливаючись, антигени мають як однакові, так і різні детермінанти.
В
1.4. Визначення титру
Готують послідовні дворазові розведення досліджуваного антигену і рівні об'єми кожного розведення вносять у лунки, розташовані по периферії тієї лунки, в якій антисироватки (стандартний об'єм). При оцінці результатів іммунодіффузіі враховують:
1. відстань, відділяє лінію преципітації від центральної і периферичних лунок;
2. останнє розведення антигену, яке ще дає видимий преципітат;
3. інтенсивність і ширину смуг преципітації.
Останнє розведення антигену, що дає преципітат, вважають його титром. Подібним чином можна титрувати вміст антитіл в антисироватки.
В
1.5. Область застосування
Якісний аналіз, наприклад для визначення числа антигенів у різних рідинах (Сироватці крові, цереброспінальної рідини), для оцінки чистоти препаратів при виділенні антигенів, для порівняння відомих антигенів і антитіл з невідомими.
Метод має високою специфічністю, при кількісних варіантах іммунодіффузіі помилка методу складає 3-7%. <В
2. Проста лінійна іммунодіффузія по Уден
В
2.1. Принцип
Гель, що містить антисироватки, поміщають в скляні трубки або пробірки. Трубки вертикально занурюють у розчин антигену, і в пробірках розчин антигену нашаровують на гель. Антигени дифундують в гель зі швидкістю, пропорційною їх концентрації, і, з'єднавшись із специфічними антитілами, утворюють з ними білувато-каламутні преципітати. Число ліній преципітації залежить від числа реагуючих систем антиген-антитіло. Чим триваліше дифузія, тим далі фронт преципітації кожній лінії видаляється від кордону, що розділяє гель і рідина. Відстань, яку він проходить за певний час при строго постійної концентрації антисироватки в гелі, залежить тільки від концентрації диффундирующего антигену. При постійних умови досвіду (температура, серія антисироватки і її концентрація в гелі, концентрація самого гелю) за допомогою простої лінійною іммунодіффузіі можна визначати кількість антигену.
В
2.2. Проведення іммунодіффузіі
В
Реагенти і прилади
моноспеціфіческой антисироватки, стандартні розчини антигенів і робочий стандарт, веронал-ацетатний буфер з pH 8,6 і іонною силою 0,1. Спеціальний агар Noble; скляні капіляри для визначення гематокриту довжиною близько 50 мм, з внутрішнім діаметром 1-1,5 мм; вимірювальна лупа з точністю до 0,1 мм.
У скляні капіляри насмоктують і видувають назад 1%-ний гарячий золь агару на воді. Потім капіляри висушують при 70 В° С. Новоутворена Агарові плівка підсилює зчеплення гелю зі склом і перешкоджає утворенню щілин, в які міг би проникнути антиген.
У 100 мл веронал-ацетатного буфера суспендується 2 г сухого агару і нагрівають на водяній бані до розплавлення. Агар охолоджують до 48 В° С і змішують з рівним об'ємом підігрітою до 48 В° С антисироватки. У цю суміш занурюють капіляри, з тим щоб вона заповнила їх на 2-3 см. Коли гель затвердіє, капіляри готові до вживання. p> Капіляри занурюють у розчини антигенів, але перед зануренням капілярів в антиген слід довести температуру всіх реагентів до потрібної величини, наприклад до 4 В° С. Реакція триває 48 ч. Потім вимірюють відстань, яку пройшов фронт преципітації в кожному капілярі.
Для того, щоб антиген міг дифундувати в гель, що містить антитіла, він повинен бути в надлишку. Швидкість міграції преципитата К можна обчислити, розділивши відстань h, на квадратний корінь з часу дифузії t.
При постійному...
