часу дифузії між логарифмом концентрації антигену і відстанню, яке проходить фронт преципітації, існує пряма лінійна залежність. Нахил калібрувальної кривої прямо пропорційний квадрату коефіцієнта дифузії антигену і обернено пропорційний концентрації антитіл в гелі і в'язкості гелю.
Оцінка методу
Критичним фактором є температура. Тривалість інкубації залежить від величини дифундуючих молекул, найчастіше триває 12, 24 або 48 годин. <В
3. Проста радіальна іммунодіффузія по Манчіні
3.1. Принцип
На рівну поверхню рівномірним шаром наносять гель, що містить антитіла. У гелі вирізають лунки і заповнюють їх розчином антигену. Молекули антигену радіально дифундують з лунки і, зустрівшись з антитілами, утворюють кільце преципітації. До тих пір поки в лунці зберігається надлишок антигену, відбувається поступове збільшення діаметра кільця преципітації.
В
3.2. Проведення дослідження
В
Реагенти та прилади
моноспеціфіческой антисироватки, стандартні розчини антигенів; робочий стандарт; веронал-ацетатний буфер з pH 8,6 і іонною силою 0,1; агар; рамки для закріплення предметних стекол, штативи для цих рамок, кювети для елюції з комплекту для електрофорезу; вимірювальний інструмент з точністю до 0,1 мм; мікрошприцем.
Нагрівають 1,5 г агару до повного розплавлення в 100 мл веронал-ацетатного буфера на водяній бані і, охолодивши до 48 В° С, змішують у потрібній пропорції з антисироваткою, підігрітою до тієї ж температури. Суміш розливають по 2 мл на предметні скла, розташовані строго горизонтально. Золь повинен рівномірно розподілитися по поверхні скла. Щоб підсилити зчеплення гелю зі склом, рекомендується попередньо покрити скло тонкої агарової плівкою.
У платівці гелю вирізують лунки, розраховані на 2 мкл антигенного розчину кожна. Після внесення антигену платівки гелю поміщають у вологу камеру і проводять іммунодіффузія при кімнатній температурі. Кільця преципітації можна вимірювати прямо на вологій платівці. Якщо преципітати видно недостатньо чітко, те спочатку елююють непреціпітіровавшіе білки в двох змінах 0,15 М розчину NaCl по 12 год, потім гель висушують і забарвлюють барвниками, наприклад аміди-чорним, і висушують знову.
Площа, займана преципітатом до кінця дифузії, прямо пропорційна вихідній концентрації антигену в лунці. Для побудови калібрувальної кривої беруть або площа преципітату як функцію концентрації антигену, або логарифм діаметра преципітату як функцію логарифма концентрації антигену:
S = K * Q A Г + S 0 ,
де S - площа преципітату, включаючи S 0 , S 0 - площа стартовою лунки і Q A Г - кількість антигену.
Нахил До отриманої прямої обернено пропорційний концентрації антитіл в гелі. Зменшивши зміст антисироватки в агарі, можна збільшити К. У результаті зросте діаметр преципітату, що підвищить чутливість і економність методу. Оптимальна концентрація антисироватки в гелі залежить насамперед від титру антитіл.
Результати іммунодіффузіі істотно не залежать від температури. Досвід може бути поставлений при 4, 20 або 37 В° С. Слід уникати тільки різких (більше 5 В°) коливань температури.
Необхідна тривалість іммунодіффузіі залежить від природи досліджуваного антигену. Перший орієнтовний завмер преципітатів можна зробити вже через 24 ч.
В
3.3. Оцінений методу
У межах своєї чутливості радіальна іммунодіффузія придатна для кількісного визначення будь-якого антигену, якщо є відповідні моноспеціфіческой антисироватки і чисті або стандартні антигени, щоб побудувати калибровочную криву для даної системи.
За допомогою цього методу частіше визначають білкові антигени, наприклад білки сироватки крові, цереброспінальної рідини, секретів залоз. Радіальна іммунодіффузія придатна також для порівняльного якісного та кількісного аналізу ІМУНОХІМІЧНИЙ близьких білків.
В
4. Нефелометрія
В
4.1. Принцип методу
Розчин антигену змішують з відповідною моноспеціфіческой антисироваткою і суміш інкубують. При цьому утворюються імунні агрегати, здатні розсіювати проходить світло. Інтенсивність розсіювання або поглинання проходить світла прямо пропорційна кількості комплексів антиген-антитіло, і її можна вимірювати фотометрически.
Якщо обсяги реагентів, розведення антисироватки, час і температура інкубації постійні і єдиною змінною величиною є концентрація антигену, то останню можна визначити по кривій екстинкції. Щоб побудувати таку криву, з антисироваткою інкубують розчини антигену зростаючої концентрації. Спочатку із збільшенням концентрації антигену крива екстинкції йде вгору, потім, після деякого максимуму, знижується. При постійній кількості антитіл підйом концентрації антигену збільшує не тільки кількість, а й величину і...
