итіла) антитіл. Ми також надивився розвиток нюхової системи, використовуючи фарбування гематоксиліном і еозином. На додаток, ми провели експерименти по засвоєнню БДУ, ин віво, з метою проаналізувати взаємозв'язок між експресією GST і клітинної проліферацією ОРК.
Матеріали та методи
Матеріали
Запліднені яйця озерної нерки (Oncorhynchus nerka), отримані з: Toya Lake Station, Field Science Center for Northern Biosphere, Hokkaido University в Листопаді 1994р. Заплідненим яйцям штучно підтримували життя аж до їх вилуплення в мінеральній воді, температурою 8-10 ° С. Ці яйця вилупилися на 70 день після запліднення. Були проведена вибірка ембріонів на 19, 26, 28, 34, 43, 52, 58 і 70 дні після запліднення. У кожен день бралася вибірка з мінімум 10 ембріонів. Для досвіду засвоєння БДУ ин віво, однорічна озерна нерка була отримана з Лабораторії в Toya Lake Station в серпні 1994 (довжина тіла 12,8 - 15, 8 см; вага тіла, 16,1 - 51,6 г.)
Гістологічна процедура.
Всі тварини були вбиті шляхом обезголовлювання, ціле тіло або голова ембріона фіксувалася розчином 4% параформальдегіду в 0,1 М фосфатного буфера (рН 7,2; РВ); промивалася 0,1 М РВ містить 10% сахарози при 4 ° С, зневоднюється через градуированную серію етанолу, і заливалася в парафін (Histosec; Merck, Darmstadt, Germany). Серія зрізів вироблялася приблизно 5 m товщиною, використовуючи мікротом, встановленим на покрите желатином скло, і сушилася на повітрі, при температурі 4 ° С. Після депарафінізації і гідратації, зрізи забарвлювалися гематоксиліном Делафільда ??і еозином; і вивчалися під світловим мікроскопом.
Імуногістохімія.
Гідратовані зрізи були інкубувати з 0,1% пероксидом водню () в метанолі на 15 хвилин, що б заблокувати активність ендогенної пероксидази, і промивали фосфатно-сольовим буфером (PBS). Зрізи инкубировались з нормальною козячої сироваткою на 15 хвилин, після інкубованих у вологих камерах з поліклональним, до лососевим нюховим soGST, антитілам, у співвідношенні 1: 1000 в PBS на 2:00 при кімнатній температурі. Специфічність антитіл до анти-soGST вже була розглянута (Shimizu et al.1993). Метод поміченого стрептавидин-біотин комплексу Histofine Kit; Nichirei, Tokyo, Japan) використовувався в імуногістохімії. Пероксидазний комплекс був визуализирован за допомогою обробки свіжоприготованим діамінобензідін тетрагідрохлорідним (0,1 мг/мл) розчином з 0,01% на 5 хвилин. Після дегідратації, зрізи були закріплені покривним склом Entellan neu (Merck). Специфічність імунної реакції була підтверджена як пред адсорбційним тестом з очищеним soGST (N24) білком (Kudo et al. 1999); так і шляхом заміщення головного антитіла нормальної кролячої сироваткою.
Засвоєння 5-бром - 2`-дезоксіурідіна (БДУ) ин віво.
Тридцяти рибам вводили внутрібоюшінно 1 мл БДУ міченого реактиву (3 мг/мл БДУ; набір клітинної проліферації, Amersham Pharmacia Biotech, Buckinghamshire, UK) на 100 г ваги риби. Після ін'єкції, риби розлучалися в критому пластиковому баку з припливом мінеральної води. На дні 0.5, 1, 3, 7, 15, 30 і 60, після маркування, зразки тканин з нюхового епітелію були підготовлені, дотримуючись процедури, описаної Kudo et al. (1996). Зрізи, суміжні до розглянутих в GST-імуногістохімії були вивчені на предмет наявності БДУ мічених клітин, сліду рекомендацій виробника набору клітинної проліферації. Для оцінки специфічності виявлення БДУ- мічених проліферуючих клітин, дві негативних контрольних процедури були представлені. В якості негативного контролю для маркування БДУ, використовували PBS замість маркування реагенту. В якості негативного контролю для імуногістохімічного виявлення БДУ, PBS, використовували замість antiБДУ антитіла.
Результати
Гістологічні зміни в нюхової системі в перебігу онтогенетичного розвитку.
Гістогенезіс нюхових плакоідов вже спостерігається на передній поверхні голови озерної нерки на 19 день життя ембріона. Нюхові плакоди складалися з декількох шарів недиференційованих епітеліальних клітин яйцевидної форми. (Fig 1А). На 25 день життя зародка, нюхові плакоди виросли, шляхом збільшення їх кількості клітин і шарів (Fig 1В). На 28 день, стала спостерігатися товста кромка сполучної тканини навколо нюхових плакод. Вільні поверхні нюхових плакод були інвагініровани, нюхові нервові аксони виступаючі з нюхових плакода до нюхових цибулин були ідентифіковані вперше (Fig. 1С). На 34 день у ембріона були вперше виявлені келихоподібних клітини в новоутворених нюхових ямках (Fig. 1Д). На 43 день у ембріона були помічені війки миготливого епітелію на поверхні нюхових ямок (Fig. 1Е). На 58 день після утворення ніздрів, нюхові ямки починали обростати сполучною тканиною. Псе...
