мунних агрегатів. При оптимальному співвідношенні антигену і антитіл кількість і розмір імунних агрегатів досягає максимуму. Область оптимальних співвідношень називають зоною еквівалентності. Подальший підйом концентрації антигену веде до зменшенню агрегатів. В
4.2. Проведення дослідження
Реагенти і прилади
забуферений фосфатами розчин NaCl. 11,9 г Na 2 HPO 4 В· 2H 2 O розчиняють в 1000 мл 0,15 М розчину NaCl; 9,1 г KH 2 PO 4 розчиняють в 1000 мл 0,15 М розчину NaCl. Виходить буфер з pH 7,5. p> моноспеціфіческой антисироватки.
Стандартні розчини. Використовуються стандартні сироватки з відомим вмістом білків або стандартні розчини, приготовані з чистих білків.
Робочий стандарт, якщо потрібно визначити зміст різних білків в сироватці або сироваткових білків в інших рідинах організму.
Стандартні розчини, досліджувані зразки та антисироватки розводять забуферений розчином NaCl з pH 7,5. Визначення антигенів виробляють з кролячими антисироватками в розведенні 1:5-1:20. Для побудови кривої екстинкції спочатку готують серію розведень антигену від 0,5 до 10 мг на 100 мл. До останніх разведениям стандартної сироватки або розчину чистого білка додають рівний обсяг розведеної антисироватки, перемішують і залишають при кімнатній температурі (20 В° С) на 2 ч. Після цього визначають екстинкцію розчинів у проходить світлі при 450 нм в мікрокювет з товщиною шару 1 см проти холостий проби (буфер + антисироватки). З досліджуваним зразком чинять так само, як зі стандартними розчинами. Визначають його екстинкцію і по висхідній частині кривої встановлюють концентрацію антигену. Якщо доводиться досліджувати мутні чи забарвлені розчини антигенів, слід попередньо виміряти їх власну екстинкцію, щоб врахувати її при оцінці результатів. Потім з урахуванням розведення вихідного матеріалу обчислюють концентрацію досліджуваного антигену.
Повну впевненість у тому, що отримана величина екстинкції відповідає області надлишку антитіл, дає дослідження, проведене з кількома разведениями антигену. Умови інкубації повинні бути строго постійними. Для фотометрії слід вибирати довжину хвилі, яка лежить за межами областей поглинання гемоглобіну (400 - 420 нм). Необхідно також враховувати спектр власного поглинання реагентів та їх суміші до утворення імунних агрегатів.
4.3. Оцінка методу
Переваги нефелометрії - відносна простота і швидкість процедури, а також можливість її автоматизації. Однак цей метод пред'являє особливі вимоги до якості антисироватки. Вона повинна містити досить антитіл, щоб у розведенні антитіл не менше 1:5 забезпечити величину максимальної екстинкції вище 0,2. Антисироватка повинна бути прозорою. <В
5. Іммунодот і іммуноспот
Твердофазний імуноферментний аналіз є найбільш популярним методом в діагностиці різних вірусних, бактеріальних, грибкових і паразитарних хвороб людини і тварин. Однак цей метод має ряд недоліків. У модифікованому варіанті для адсорбції різних антигенів використовують нітроцелюлозні фільтри. Таку модифікацію називають dot-ELISA (точковий твердофазний імуноферментний аналіз). У dot-ELISA мінімальні обсяги розчинів антигену або антитіл наносять на нітроцелюлозну підкладку у вигляді серії точок. Преципітуючих хромогенні субстрати на білому нітроцелюлозну фільтрі утворюють кольорові плями. Фільтри з результатами аналізу можуть зберігатися в темряві протягом багатьох років без втрати забарвлення.
У dot-ELISA можна застосовувати різні препарати антигенів. На нітроцелюлозних мембранах можна сорбувати як життєздатні або фіксовані формаліном найпростіші, так і супернатанти, отримані після руйнування клітин. p> Пляма антигену наносять в обсязі від 0,1 до 3 мкл. У разі препаратів солюбізірованних антигенів переважніше використовувати мембрани з малим діаметром пор. При застосуванні цілих клітин величина пір не грає великої ролі.
Всі стадії інкубації і промивання виконують при кімнатній температурі. Спочатку диски з антигеном обробляють блокуючим розчином (3 - 5%-ний розчин очищеного бичачого сироваткового альбуміну в сольовому тріетаноламіновом буферному розчині). Можна успішно застосовувати і цільну кінську сироватку або 1%-ний розчин нормальної сироватки кролика у фосфатному буферному розчині з NaCl. При виявленні антитіл 50 мкл сироватки в 1%-ном розчині БСА-СТБ інкубують на диску. Антитіла специфічно зв'язуються з антигеном, сорбованому на диску. Потім диски тричі промивають у розчині детергенту (0,05%-ний розчин нонідета Р-40 в СТБ, 0,05%-ний розчин твіну-20 в сольовому розчині трис-НCl). Після промивання диски інкубують з 50 мкл кон'югату афінно очищених антивидових антитіл з ферментом (пероксидаза, лужна фосфатаза). p> Після відмивання незв'язаних матеріалу додають преципітує хромогенний субстрат. При окисленні субстрату ферментом ...
