мі присутні глюкоцереброзідов, зміст яких у дорослих тварин вкрай низьке. В інших же тканинах можуть бути як галакто-, так і глюкоцереброзідов, в крові ж переважають глюкоцереброзідов.
ТШХ хроматографія має ряд переваг в порівнянні з рідинної хроматогрфіей:
) Проста і зручна, можливе використання готових пластинок
) Недороге обладнання, яке може бути встановлено в кожній лабораторії
) ТШХ перевірена в багатьох областях, в тому числі у фармакології. Дозволяє легко проводити кількісне визначення
) У ТШХ відсутній «ефект пам'яті» в тому випадку, якщо кожен раз використовується нова нерухома фаза. У той час як при ЖХ залишковий ефект від минулого прогону не може бути повністю виключений
) ТШХ потребує набагато меншій кількості розчинників, ніж ВЕРХ
) Після поділу шляхом ТШХ ліпіди можна легко візуалізувати за допомогою барвників, які специфічно зв'язуються з різними функціональними групами. Працювати з постколоночнимі похідними складніше.
Розділені за допомогою ТШХ ліпіди можуть бути візуалізовані за допомогою різних барвників, які можна розділити на три групи:
Недеструктивні і неспецифічні. Пари йоду, діхлорфлуоресцін, родамін. Однак повністю насичені ліпіди погано прокрашиваются, в той час як з сильно ненасичених йод виводиться не до кінця. Деструктивні і неспецифічні. Обробка пластинок після ТШХ їдкими речовинами і пропалювання пластинки до прояву ліпідів. Часто використовують 5 -% - ную сірчану кислоту в розчині води або метанолу, а потім протягом години прогрівають при температурі 120? С. Хоча механізми і незрозумілі, відомо, що насичені і ненасичені ліпіди вимагають різного часу для повного обвуглювання. Інтенсивність таких чорних плям може підлягати кількісному обліку. Деструктивні, специфічні. Селективно реагують з певною частиною ліпідів з утворенням забарвлених продуктів. Далі наведу деякі реагенти, використовувані для визначення гликолипидов:
Гліколіпіди:
) орцінол в сірчаної кислоти. Синьо-фіолетові плями на білому фоні
) 5-гідрокси - 1-тетралон в 80% сірчаної кислоти. Гліколіпіди дають жовті плями, легко відрізняються від світло-блакитних плям фосфоліпідів
Гангліозид:
Резорцин, HCl. Тільки гангліозиди проявляються синьо-фіолетовими плямами, в той час як інші гліколіпіди - жовті.
Сфінголіпіди:
Гіпохлорит натрію NaClO/бензидин. Всі ліпіди, несучі вторинну аміногрупу
Також можна використовувати моноклональні антитіла до гліколіпідом, цей метод значно спрощує специфічне визначення окремих компонентів на хроматогрфіческой платівці і може бути поєднаний з мас-спектрометричним визначенням.
Основні принципи методу ТШХ. Роздільна сумарних цереброзидів і сульфатідов, виділених з загальних ліпідів, проводять за допомогою різних систем розчинників. Після хроматографічного розділення ліпідів пластинки виймають з хроматографічної камери, висушують і проявляють парами йоду. Після випаровування йоду окремі фракції елюіруют. Для елюювання використовують ту ж систему розчинників, що і для хроматографічного розділення. Елюат упарюють і проводять їх кількісне визначення.
Оптимальну суміш розчинників вибираємо в залежності від конкретної групи гликолипидов, яку ми хочемо досліджувати. Слабополярной гликосфинголипидов краще розчиняти в слабополярной розчинниках, сільнополярних гликосфинголипидов - в сільнополярних. Полярність суміші розчинників варіюється за рахунок зміни співвідношення полярних і неполярних речовин у ній (так, зменшуючи частку хлороформу у суміші, ми збільшуємо її полярності).
Так, наприклад, в результаті хроматографії з використанням системи хлороформ - метанол - вода (60: 35: 8) відбувається поділ на 5 фракцій, де перші дві фракції є сульфатідов, а 3,4 і 5 я фракції представляють цереброзидів.
Для виділення саме сульфатідов добре підходять системи хлороформ- метанол - ацетон -уксусная кислота - вода (46:15:: 1 714: 8) і хлороформ - метанол - оцтова кислота (65:25:10) і ін.
Зовсім недавно були отримані приголомшливі результати високо ефективної ТШХ з поділом 9ти різних сульфатідов, при цьому використовувалися пластинки з силікагелю і 2 системи розчинників: хлороформ - метанол - 0,2% CaCl2 (55:45:10) на першій стадії і хлороформ - метанол - ацетон - оцтова кислота - вода (5: 2: 4: 2: 1) на другій стадії.
Хроматографічне розділення загальної фракції ліпідів, виділеної методом Фолча і звільненої від ганглиозидов, проводять в системі розчинникі...
