в хлороформ - метанол - конц.NH3 (80: 20: 0,4). У результаті так само відбувається відділення сульфатідов від цереброзидів.
Роздільна цереброзидів на галакто- і глюкоцереброзідов методом ТШХ
Роздільна цереброзидів на галакто- і глюкоцереброзідов засновано на різній здатності галактози і глюкози утворювати боратному комплекси, що володіють різною хроматографічної рухливістю. Ісползуется 1% -ний розчин Na2B4O7 і систему розчинників хлороформ - метанол - вода - 15М NH4OH. Так, загальні цереброзидів, виділені з головного мозку новонароджених та 10-денних щурів, поділяються на 2 фракції галактоцереброзідов і одну фракцію глюкоцереброзідов.
3.2 ТШХ, поєднана з мас-спектрометрометріей
Давно визнаним і випробуваним методом вважається ВЕРХ, проведена разом з мас-спектрометрією, коли мас-спектри пишуться паралельно з виходом фракцій. У минулому було безліч спроб поєднати ТШХ з мас-спектрометрією, і це стало можливим тільки з відкриттям технік м'якої іонізації і десорбційної мас-спектрометрії MALDI.
Звичайно, можна було б поєднати з мас-спектрометром наступним чином: після проведеної ТШХ елюіровать з платівки силікагелю пляма інтересу і потім піддати мас-спектрометрії. Виконувати таку роботу занадто утомливо і времязатратно. Методи електро-спрею і MALDI дозволили вирішити цю проблему. На MALDI зупинимося трохи більш докладно. Цей метод має ряд переваг.
По-перше, немає необхідності елюіровать зразки з хроматографічної пластинки перед МС-аналізом. Це дуже зручно і дозволяє уникнути втрати ліпідів у процесі виділення.
По-друге, така методика дозволяє проводити визначення дуже швидко, а значить мінімізувати такі модифікації досліджуваного матеріалу, як окислення.
По-третє, цей метод має набагато більшою роздільною здатністю в порівнянні з візуаліза?? ией на хроматографічної платівці, тому що роздільна здатність визначається розміром лазерної плями, яке зазвичай порядку 50нм. Це означає, що з однієї плями на хроматографічної платівці розміром 1мм ми можемо отримати 20 різних мас-спектрів. Це дозволяє розділити такі компоненти, які ніколи не могли б бути розділені методом загального окрашіванія.визивает іонізацію і переклад зразка з конденсованої фази в газову допомогою лазерного збудження та індивідуалізації молекул зразка з матриці (рис. 1.14). У MALDI аналізі аналіт спочатку сокрісталлізуется з великим молярним надлишком матричного з'єднання, зазвичай УФ-поглинаючої слабкою органічною кислотою. Опромінення такої суміші аналіту з матрицею лазером призводить до випаровування матриці, яка несе аналіт в собі. Матриця відіграє ключову роль у цьому методі. Сокрісталлізованние молекули зразка також випаровуються, але без прямого поглинання енергії лазера.
У більшості випадків при вивченні гликолипидов використовують УФ-лазери, хоча є приклади, коли використовувалися і ІЧ-лазери. Ік-лазери мають 2 переваги. По-перше, в якості матриці можна використовувати гліцерин, а тому це рідина, то не виникає проблем з необднородной ко-кристалізацією матриці і аналізованого речовини. По-друге, ІЧ-випромінювання глибше проникає в зразок
Разом з MALDI можна застосовувати антитіла, як прямий метод ідентифікації гликолипидов. Використовуючи антитіла разом з технікою ТШХ - ІЧ-MALDI-MS можна досягти межі чутливості менш 1нг. Це дозволяє безпосередньо використовувати неочищені ліпідні екстракти, без складної процедури попереднього виділення гликолипидов.
3.3 Кількісне визначення окремих фракцій цереброзидів і сульфатідов по вуглеводному компоненту
Для кількісного визначення виділених, очищених цереброзидів може бути використаний метод Радіна. Цей метод заснований на реакції розчинених у H3PO4 цереброзидів і сульфатідов з АНТРОН - поліциклічним з'єднанням.
При цьому розвивається синьо-зелене забарвлення, інтенсивність якої пропорційна кількості галактози в цереброзидів. Однак антроновая реакція вразлива до забруднень і не може застосовуватися для кількісного аналізу гликолипидов, отриманих в результаті ТШХ.
Більш підходящий варіант кількісної оцінки окремих фракцій цереброзидів і сульфатідов по вуглеводному компоненту виявилося поєднання двох методів: Радіна і Свеннерхольма. За методом Радіна осад гликолипидов расвторяют в 85% -ної H3PO4, далі за методом Свеннерхольма проби охолоджують і додають орціновий реактив. Після перемішування і витримування проб на водяній бані при 80? С протягом 20хв в пробах розвивається червоне забарвлення, інтенсивність якої пропорційна кількості вуглеводів. Потім проби фотометрируют. Для визначення галактоцереброзідов калибровочную криву будують по стандартному розчину га...
