нак, при промиванні водою відбувається втрата ліпідного матеріалу, головним образів, кислих ліпідів (0,3 - 0,6% від загального вмісту ліпідів). Тому автори методу замість води запропонували використовувати слабкі розчини мінеральних солей (KCl, CaCl2, NaCl). Зменшення втрат ліпідів при використанні солей пов'язано, мабуть, з тим, що кислі ліпіди екстрагуються з тканин у вигляді солей калію, кальцію, натрію і присутні у верхній фазі в диссоциированной формі. Слід зазначити, що застосування сольових розчинів для промивання значно знижує, але не усуває втрату ліпідів повністю.
Промивання здійснюють наступним чином. До відфільтровану екстракту ліпідів додають водний розчин солі в обсязі рівному 0,2 від обсягу ліпідного екстракту. Проби перемішують і піддають розшарування або шляхом відстоювання, або шляхом центрифугування. Таким чином, система поділяється на дві фази. Верхню фазу, яка містить полярні речовини, видаляють, а внутрішні стінки пробірки і поверхню нижньої фази обполіскують сумішшю хлороформ - метанол - водний розчин солі. Промиванні піддається тільки поверхню нижньої фази, тому щоб уникнути втрат ліпідів можна допускати перемішування нижній фази з промивної сумішшю.
Далі до хлороформно суміші ліпідів додають трохи метанолу і або проводять висушування в термостаті, або видаляють розчинник за допомогою вакуумного роторного випарника.
Виділення цереброзидів і сульфатідов:
Ліпідний екстракт фільтрують і сумішшю хлороформу і метанолу доводять до необхідного обсягу. Із загального ліпідного екстракту проводять витяг ганглиозидов.
Нижній хлороформний шар, що не містить ганглиозидов, доводять метанолом до необхідного обсягу (20мл суміші на 1г тканини) і використовують для виділення сумарних цереброзидів і сульфатідов за методом Азмена.
Виділення сумарних цереброзидів і сульфатідов за методом Азмена.
Принцип методу: виділення осаду цереброзидів і сульфатідов за методом Азмена засноване на їх здатності утворювати щільний білий шар на кордоні хлороформного і водного шарів при обробці хлороформних-метанолового екстракту ліпідів трихлороцтової кислотою (ТХУ, CCl3СООН) і водою.
Хід виділення:
хлороформних-метаноловий екстракт ліпідів, звільнений від ганглиозидов і водорозчинних домішок, охолоджують в лазні з льодом до 2-3? С. Потім додають 4% -ву ТХУ. Суміш залишають на 2:00, періодично струшуючи, після чого проводять її центрифугування (15-20 хв при 3000 об/хв) до повного поділу рідини на 2 шари.
Верхній шар видаляють, а до нижнього додають рівний обсяг дист. води. Суміш струшують, витримують 1ч в лазні з льодом, а потім центрифугують (30 хв при 3000 об/хв). У результаті утворюється 3х-фазна система: верхній водний шар, плівка цереброзидів і сульфатідов і нижній шар.
Чи не руйнуючи гліколіпідной плівки, обережно видаляють верхній і нижній шари. Отримані гліколіпіди емульгують в 5-6 мл води, переносять в целофановий мішечок і піддають диализу проти дист. води протягом 2х діб при 2-3? С, неодноразово міняючи воду в діалізаторі.
Після діалізу вміст мішечка переносять в пробірку і центрифугують протягом 15 хв. Отриманий осад розчиняють у 2 мл суміші хлороформ - метанол (1: 1).
Потім проводять очищення осаду цереброзидів і сульфатідов від фосфоліпідів шляхом випарювання при 60? С. Цереброзидів і сульфатиди утворюють на стінках пробірки плівку, яку соскабливают скляною паличкою. Далі проводять 2-кратну екстракцію сумарних цереброзидів і сульфатідов киплячим ацетоном.
Сумарні цереброзидів і сульфатиди, розчинені в гарячому ацетоні, фільтрують у пробірки, закривають пробками і залишають на ніч у холодильнику. Випав за ніч осад очищених Ц і С відокремлюють центрифугуванням, розчиняють в 1 мл суміші хлороформ - етанол (1: 1) і іспльзуется для подальших досліджень.
Описаний метод виділення дозволяє виділити з головного мозку одного дорослої тварини 1-1,5 мг сумарних цереброзидів і сульфатідов, що достатньо для поділу їх методом ТШХ, кількісної оцінки отриманих фракцій і визначення питомої радіоактивності.
3. Методи визначення цереброзидів і сульфатідов.
.1 Роздільна цереброзидів і сульфатідов методом ТШХ
Використання методів колонкової та тонкошарової хроматографії дозволило встановити гетерогенність цереброзидів і сульфатідов - наявність окремих фракцій, що відрізняються головним чином за складом ЖК, причому досить різноманітних. Вуглеводний склад цереброзидів і сульфатідов представлений, найчастіше, галактозою, проте не завжди. Так, в головному мозку новонароджених тварин поряд галактоцереброзіда...
