при кімнатній температурі. [3]
. Розчин для злиття клітин. Агентом, пришвидшує злиття клітин, є поліетиленгліколь (ПЕГ). Здатність ПЕГ індукувати злиття зростає при збільшенні концентрації, однак при тих концентраціях, які найбільш ефективні відносно злиття, проявляються токсичні властивості ПЕГ.
Важливе значення має рН розчину ПЕГ. Максимальне число клонів виходить при рН 8,0 - 8,5. Ефективність злиття можна підвищити, додавши в розчин ПЕГ 5 - 15% диметилсульфоксиду. Для оптимізації процесу злиття з середовища видаляють сироватку, оскільки вона перешкоджає адгезії клітин.
Токсичність ПЕГ можна перевірити в попередніх експериментах. Для цього обробляють розчином ПЕГ мієломні клітини при таких умовах, в яких проводитиметься злиття, потім засівають оброблені клітини в культуру при низькій щільності і порівнюють їх зростання з ростом необроблених клітин.
Для приготування розчину ПЕГ беруть 2 г ПЕГ 4000, поміщають у пробірку і розплавляють у водяній бані при 70 ° С. До розплавленого ПЕГ додають 0,4 мл диметилсульфоксиду і 2 мл середовища RPMI 1640. Пробірку залишають відкритою на повітрі до тих пір, поки рН розчину не стане лужним (8,0 - 8,5). Після цього теплий розчин стерилізують фільтрацією через мембранні фільтри і тримають до досвіду в термостаті при 37 ° С. [1]
. Середа для культивування мієломних клітин. Повна середу з 10% СПК готується з наступних компонентів:
Середа RPMI 1640 або середу Голка в модифікації Дульбекко, одноразової концентрації - 450 мл;
мл 100 мМ розчину пірувату натрію;
мл 100-кратного розчину антибіотиків;
мл 200 мМ розчину L-глютамина;
, 25 мл 0,1 М розчину 2-меркаптоетанол;
мл 1 М буфера HEPES;
мл СПК.
Цю середу використовують для культивування мієломних клітин і при масовому розмноженні гібридомних клітин. При початковому культивуванні гібридомних клітин та їх клонуванні концентрацію СПК збільшують до 15 - 20%. При використанні середовища Дульбекко в неї додають ще глюкозу до кінцевої концентрації 4,5 г/л.
Середовища ДАТ або ГТ готують шляхом додавання 5 мл відповідного 100-кратного розчину до 500 мл повної середовища. [4]
3. Отримання моноклональних антитіл
Основні етапи отримання моноклональних антитіл наведені на малюнку 1.
Рис.1. Основні етапи отримання міноклональних антитіл:
- імунізація тварини; 2 - приготування суспензії клітин селезінки; 3 - злиття; 4 - клонування гібридом з позитивних лунок; 5 - розмноження клітин з позитивних лунок
3.1 Приготування суспензії мієломних клітин
Для гібридизації вибирають клітини культивованої мишачої мієломної лінії SP2/O - Ag14 або X63-Ag8.6.5.3., резистентні до 8-азогуаніну.
Суспензію мієломних клітин готують наступним чином:
) 50 мл середовища з культивованими МІЄЛОМНОЮ клітинами, що знаходяться в логарифмічною стадії росту, центрифугують протягом 8 хв при 800 об/хв, надосадок зливають в окрему пробірку.
) Клітки суспендують у 50 мл холодної ростової середовища без сироватки, відмивають центрифугуванням при тих же умовах і суспендують у 20 мл холодної бесивороточной середовища.
) Клітки підраховують в камері Горяєва. Їх кількість повинна бути не менше 107. [4]
. 2 Імунізація тваринного
Призначення імунізації полягає в тому, щоб збільшити частку клітин, що продукують антитіла заданої специфічності, і перевести ці клітини в функціональний стан, при якому вони здатні зливатися і утворювати антітелообразующіе гібридні клітини.
Вибір експериментального тварини визначається наявністю батьківських мієломних ліній, можливістю отримання гібридів клітин цих ліній і імунних лімфоцитів. Зазвичай для імунізації використовують мишей і щурів. Це пов'язано з тим, що відповідні мієломні клітини мишей і щурів широко поширені і, крім цього, не представляє складнощів вирощування отриманих гібридом в організмі цих тварин. Зазвичай для імунізації використовують самок мишей - самок инбредной лінії BAL B/c у віці 8 - 12 Нделе.
Конкретна схема імунізації залежить від природи антигену і його імуногенності. Антигени клітинної поверхні є сильними імуногенний, тоді як більшість розчинних білків - слабкі іммуногени. Необхідно застосовувати різні ад'юванти - речовини, що підсилюють імунну відповідь. Серед ад'ювантов найбільшого поширення отримав повний ад'ювант Фрейнда (П...
