ації Ісакова. [1]
середу Голка. Середа Голка, як правило, придатна для культивування більшості клітинних ліній. Середа Голка містить солі, глюкозу, 12 незамінних амінокислот і 9 вітамінів. Перед вживанням разом із сироваткою додаються глютамін і, якщо необхідно, антибіотики. [3] Вміст амінокислот і вітамінів в середовищі Голка в модифікації Дульбекко наведено в таблиці 1.
Таблиця 1. Амінокислотний і вітамінний склад середовища Голка в модифікації Дульбекко [3]
КомпонентСодержаніе в живильному середовищі, мг/лКомпонентСодержаніе в живильному середовищі, мг/лАмінокіслоти L-триптофан16,0L-аргинин-HCl84,0L-тирозин72,0L-цистин48,0L-валин94,0L-глютамин584,0ВитаминыL-глицин30,0L-гистидин-HCl?H2O42,0D-Ca-пантотенат4,0L-изолейцин105,0Холинхлорид4,0L-лейцин105,0Фолиевая кислота4,0L-лизин-HCl146,0i-инозитол7,2L-метионин30,0Никотинамид4,0L-фенилаланин66,0Пиридоксаль-HCl4,0L-серин42,0Рибофлавин0,4L-треонин95,0Тиамин-HCl4,0
Середа RPMI 1640. середу являє собою розчинену в очищеній воді суміш неорганічних солей, амінокислот, вітамінів, глюкози і фенолового червоного, простерилізованих фільтруванням через фільтри з діаметром пор 0,1 мкм. У таблиці 2 наведено склад середовища RPMI 1640.
Таблиця 2. Склад середовища RPMI 1640 [3]
КомпонентСодержаніе в живильному середовищі, мг/лКомпонентСодержаніе в живильному середовищі, мг/лАмінокіслоти Холинхлорид5,00L-аланин13,90D-Ca-пантотенат0,20L-аргинин-HCl42,10Фолиевая к-та10,00L-аспарагін45,00i-інозіт36,00L-аспарагінова к-та19,97Нікотінамід0,50L-цістеін31,50Нікотіновая к-та0,50L-глютамінова к-та22,10ПАБК1,00L-глютамин219,20Пиридоксаль-HCl0,50Глицин7,50Пиридоксин-HCl0,50L-гистидин-HCl?H2O20,96Рибофлавин0,20L-гидроксипролин19,70Тиамин-HCl0,20L-изолейцин39,36Цианокобаламин2,00L-лейцин39,36СолиL-лизин-HCl36,50CaCl2100,0L-метионин14,90KCl400,0L-фенилаланин16,50MgSO4?7H2O200,0L-пролин17,30NaCl6460,0L-серин26,30NaHCO32200,0L-треонин17,90NaH2PO4?H2O580,0L-триптофан3,10Другие компонентиL-тірозін18,10Феноловий красный10,0L-валин17,60Глюкоза3000,0ВитаминыГлутатион0,50Аскорбиновая к-та0,50Бакто-пептон600,0Біотін0,20СПК0 - 30%
2.2 Приготування окремих компонентів середовищ для культивування
. 100-кратний концентрат ГТ (гіпоксантин, тимідин). 136,1 мг гіпоксантину і 38,75 мг тимідину додати до 50 мл води, потім по краплях при постійному перемішуванні додавати 0,1М NaOH до повного розчинення реагентів. Довести об'єм до 100 мл, профільтрувати і заморозити при - 20 ° С. [1]
. 100-кратний концентрат Аміноптерин. 1,76 мг Аміноптерин розчинити в 100 мл води, профільтрувати, профільтрувати, зберігати при - 20 ° С. Розчин Аміноптерин необхідно оберігати від світла. [4]
. Вибір сироватки. Найбільшою здатністю підтримувати зростання гібридомних клітин володіє сироватка плода корови (СПК). Найчастіше використовують неінактівірованную сироватку, хоча іноді її інактивують прогреванием при 56 ° С протягом 30 хв для зменшення можливої ??токсичності компонентів. СПК є одним з найдорожчих компонентів середовища культивування, тому поводитися з нею необхідно економно. Для культивування клітин відразу після злиття, а також для клонування, використовують високу концентрацію СПК (15 - 20%). Як тільки гібридоми відібрані, їх можна поступово переводити на зростання в 10% СПК. Якщо клітини добре адаптувалися, то концентрацію можна знизити до 5%.
У попередніх експериментах визначають сироватку, що володіє найкращою здатністю підтримувати зростання гібридомних клітин. З клітин, взятих на логарифмічній фазі росту (якщо готових гібридомних клітин немає, використовують мієломні батьківські клітини), готові чотири суспензії, що містять 2000, 1000, 500 і 250 клітин в 1 мл. Поміщають по 150 мкл середовища, що містить 20% тестованої сироватки, в лунки 1 - 6 96-ти лункового планшета. У лунки 1 - 7 вносять контрольну сироватку для порівняння. Закапують по 20 мкл кожної суспензії клітин в 24 лунки. Планшет поміщають в CO2-інкубатор. Через 7 - 10 днів оцінюють швидкість росту клітин.
Замість СПК застосовують і інші сироватки: сироватку новонароджених телят, сироватку корів, кінську сироватку, кролячу сироватку. [1]
. Буфер Hepes. Hepes - скорочене позначення 4- (2-гідроксіетил) - 1-піперазінетансульфоновой кислоти. Буфер Hepes нетоксичний для клітин і використовується замість бікарбонату. Буфер використовується в концентрації 10 - 25 мМ і додається в середу з концентрату, який готується наступним чином:
, 6 г буфера Hepes розчинити в 200 мл дистильованої води і довести до рН 8,1 за допомогою NaOH.
Стерилізувати фільтруванням, використовуючи мембранні фільтри з діаметром пор по 0,22 мкм і зберігати ...
