АФ). ПАФ містить убиті туберкульозні мікобактерії, суспендовані в масляній фазі водної емульсії.
Використовують наступну схему імунізації:
) Тварині вводять внутрішньочеревно розчинні білкові антигени (50 - 100 мкг), змішані з рівним об'ємом ПАФ.
) Через 2 - 3 тижні проводять повторну імунізацію без ад'юванта.
) Через 2 - 4 тижні після останньої імунізації беруть проби з хвостової вени миші. Вибирають тварин, що мають найбільший титр антитіл (титр антитіл - величина, зворотна розведенню сироватки, при якій ступінь імунологічної реакції знижується в два рази в порівнянні з максимальною).
) Проводять гипериммунизации внутрішньовенно в хвостову вену (100 мкг) без ад'юванта, або внутрішньочеревно протягом трьох днів по 30 мкг.
) Через три дні після внутрішньовенної гипериммунизации миша забивають цервікальної дісклокаціі і беруть селезінку. При гипериммунизации, проведеної внутрибрюшинно, миша забивають на наступний день. [1]
. 3 Приготування суспензії клітин селезінки
Суспензію клітин селезінки готують наступним чином:
) Тварина занурюють у 70% -ний етиловий спирт, витягають. У стерильних умовах витягують селезінку і поміщають її в чашку Петрі, що містить 5 мл середовища RPMI +1640 з 2,5% СПК і злегка промивають її. Ножицями роблять кілька надрізів.
) Переносять селезінку в скляний гомогенізатор зі слабко притертими товкачем. Дуже обережно товкачем розтирають селезінку, залишають на 5 хв для осадження крупних частинок і переливають у центрифужную пробірку на 50 мл.
) Доводять обсяг пробірки до 30 мл додаванням холодної бессивороточной середовища і відмивають клітини центрифугуванням протягом 8 хв при 800 об/хв.
) Для видалення з суспензії клітин еритроцитів осад суспендують у 15 мл 0,83% -ного розчину NH4Cl на льоду, через 5 хв інкубації обережно подслаівают 10 мл будь сироватки і центрифугують протягом 8 хв при 800 об/хв. Надосадок з лизировать в NH4Cl еритроцитами відкидають.
) Осад чистих спленоцитів суспендують у 20 мл холодної бессивороточной середовища.
) Підраховують життєздатні клітини в камері Горяєва в суміші 20 мкл клітинної с?? спензіі з 1 мл 0,1% -ного розчину трипанового синього. Життєздатні клітини повинні становити не менше 80%. [1]
. 4 Злиття клітин
) Змішують суспензії клітин мієломи та селезінки у співвідношенні 1:10 і центрифугують протягом 8 хв при 800 об/хв., супернатант видаляють, пробірку поміщають у водяну баню на 37 ° С і тримають там протягом всього часу обробки.
) Через 1 хв додають протягом 1 хв 1 мл теплого (37 ° С) розчину ПЕГ. Під час додавання перемішують осад кінчиком піпетки. Продовжують перемішування осаду протягом ще 1 хв.
) Тієї ж піпеткою додають 1 мл теплого середовища без СПК протягом 1 хв, постійно перемішуючи суспензію клітин кінчиком піпетки.
) Повторюють етап 3.
) Додають при постійному розмішуванні суспензії клітин ще 7 мл середовища без СПК протягом 2 - 3 хв.
) Суспензію центрифугують 8 хв при 800 об/хв. Осад ресуспендіруют в 10 мл теплої середовища з СПК, переносять суспензію у флакон, що містить 70 мл теплої середовища з СПК.
) засівайте по 0,2 мл цієї суспензії в лунки чотирьох 96-лункових планшетів для культивування клітин, планшети поміщають у вологий СО2-інкубатор з 5% СО2.
) Через 24 год за допомогою пастерівської піпетки, приєднаної до вакууму, видаляють приблизно 0,1 мл з кожної лунки і додають у кожну лунку по 0,1 мл ДАТ.
) Через 10 - 14 днів перевіряють мікропланшети на появу клонів гібридом і замінюють середу ДАТ на середу ГТ, яку замінюють на свіжу кожні 3 дні, поки що виросли клітини не займуть 1/4 площі лунок.
) Переходять на ГС, яку також замінюють на свіжу кожні 2 - 3 дні, видаляючи 1 мл культуральної рідини.
) Після досягнення клітинами стадії слившегося моношару перевіряють активність антитіл в культуральній рідині. Якщо культура продовжує продукувати цікавлять антитіла, клітини клонують, використовуючи для цього невелику частину культури.
) Частину культури розмножують послідовним переносом клітин в культуральні судини більшого розміру. [1]
3.5 Клонування гібридом
моноклональний антитіло клонування гібрид
Клонування здійснюється для виділення стабільних клонів гібридомних клітин. Для недавно утворилися гібридомних клітин характерна висока не...
