Furiosus . Молекули PCNA і RFC необхідні для ДНК-полімерази для виконання поступального синтезу ДНК. Молекулярний механізм процесу завантаження затиску активно досліджувався (рис. 5).
Проміжний PCNA-RFC-ДНК, в якій кільце PCNA відкрито під внеплоскостном режимі, було виявлено аналізом частинок електронно-мікроскопічних зображень білків P. furiosus (рис. 6). Нещодавно були опубліковані кристалічна структура комплексу, в тому числі АТФ-пов'язана структура затиску, розкриття циклу затиску матричного праймера ДНК з використанням білків бактеріофага Т4, і знання наші про механізм запуску затиску постійно прогресують.
Малюнок 4. PCNA-взаємодіючі білки.
Після завантаження затиску ДНК-полімераза отримує доступ до затискачів і затиск-полімеразної комплексу, що виконує процес поступального синтезу ДНК. Таким чином, структурний і функціональний аналіз ДНК-полімерази PCNA-комплексу є наступною метою з'ясування загальних механізмів реплікації прогресивної виделкою. Взаємодіючі білки PCNA містять невелику кількість стислій інформації про фрагменти послідовності, званої PIP-бокс, який зв'язується з загальними областями на PCNA. бокс складається з послідовності «Qxxhxxaa», де «х» позначає будь-яку амінокислоту, «h» являє собою гідрофобний залишок (наприклад, L, I або M) і «а» позначає ароматичний залишок (наприклад, F, Y або W). ДНК-полімерази архей мають PIP-бокс-фрагменти в їх послідовності.
Проте, тільки в декількох дослідженнях експериментально досліджувалась функція фрагментів. Була визначена кристалічна структура Pol B в P. furiosus у вигляді комплексу з мономірним мутував PCNA, і була побудована переконлива модель полімеразної кільця PCNA . Це дослідження показало, що нова взаємодія утворюється між розтягнутій петлею PCNA і виступом області Pol B, на додаток до автентичного PIP-боксу.
Порівняння моделі структури з раніше вивченої структурою ДНК полімерази B-сімейства з фага RB69, що утворює комплекс з ДНК припустило, що друге місце у взаємодії відіграє вирішальну роль в перемиканні між полімеразної і екзонуклеазним режимами, індукуючи складову конфігурацію PCNA-полімерази, яка сприяє синтезу після редагування.
Цей передбачуваний механізм для контролю точності репликативной ДНК-полімерази підтверджується досвідом, в якому мутації на другий галузі взаємодіїя посилюються екзонуклеазной активністю у присутності PCNA. Крім того, тривимірну структуру потрійного комплексу ДНК-полімерази-PCNA аналізували за допомогою аналізу часток на електронному мікроскопі (ЕМ).
Це структурний уявлення показало повну конфігурацію домену тримерного кільця PCNA-полімерази і ДНК, у тому числі контактів типу білок-білок або білок-ДНК. Така архітектура забезпечує більш чітке уявлення в механізмі перемикання між режимами редагування та синтезу.
Малюнок 5. Механізм поступального синтезу ДНК.
На відміну від більшості евріархейних організмів, які мають один гомотрімерний гомолог PCNA, який утворює циклічну структуру, більшість кренархей мають кілька гомологів PCNA, і вони здатні утворювати гетеротрімерние кільця для їх функції. Особливо цікаво наявність трьох PCNA - PCNA1, PCNA2 і PCNA3, с...
