це має при роботі з невеликими кількостями ДНК у зразку. Крім того, навіть слідові кількості GuSCN можуть інгібувати ПЛР. Тому при використанні цього методу дуже важливий правильний вибір сорбенту та ретельне дотримання технологічних нюансів.
Інша група методів пробопідготовки заснована на використанні ионообменников типу Chilex, які, на відміну від скла, сорбують чи не ДНК, а навпаки, домішки, що заважають реакції. Як правило, ця технологія включає дві стадії: кип'ятіння зразка та сорбція домішок на іонообміннику. Метод надзвичайно привабливий простотою виконання. У більшості випадків він придатний для роботи з клінічним матеріалом. На жаль, іноді зустрічаються зразки з такими домішками, які неможливо видалити за допомогою іонообмінників. Крім того, деякі мікроорганізми не піддаються руйнуванню простим кип'ятінням. У цих випадках необхідно введення додаткових стадій обробки зразка.
Таким чином, до вибору методу пробопідготовки слід ставитися з розумінням цілей проведення передбачуваних аналізів.
2.2 Ампліфікація
Для проведення реакції ампліфікації необхідно приготувати реакційну суміш і внести в неї аналізований зразок ДНК. При цьому важливо враховувати деякі особливості відпалу праймерів. Справа в тому, що, як правило, в аналізованому біологічному зразку присутні різноманітні молекули ДНК, до яких використовуються в реакції праймери мають часткову, а в деяких випадках значну, гомологію. Крім того, праймери можуть Отжигают один з одним, утворюючи праймер-димери. І те, і інше призводить до значної витрати праймерів на синтез побічних (неспецифічні?? х) продуктів реакції і, як наслідок, значно зменшує чутливість системи. Це ускладнює або унеможливлює читання результатів реакції при проведенні електрофорезу.
3. Застосування ПЛР в діагностиці грипу
Грип займає одне з провідних місць у структурі інфекційної патології людини. У всіх країнах світу основний економічний збиток від інфекційних захворювань завдають саме грип і гострі респіраторні вірусні інфекції (ГРВІ). У Росії на їх частку припадає приблизно 90% всієї реєстрованої інфекційної захворюваності. За даними офіційної статистики в РФ щорічно реєструється від 900 000 до 3500000 випадків грипу, при цьому помирає від 20 до 53 тисяч осіб на рік.
Захворюваність на грип істотно коливається в різні пори року, збільшуючись, як правило, в осінньо-зимовий час. Тим не менш, випадки грипу можуть реєструватися навіть у межепідеміческій період. Історія вивчення грипу сягає своїм корінням ще в середні століття. Перша епідемія, про яку ми знаємо, мала місце в 1889-1890 рр. і була викликана підтипом вірусу грипу А (H2N8). Завдяки унікальним властивостям вірусу грипу А і насамперед його здатності до зміни антигенної структури, специфічний імунітет, набутий після перенесеного захворювання, практично не захищає від інфікування новим штамом вірусу грипу. Під час щорічних спалахів та епідемій грипу та інших ГРВІ захворює кожен 10-й дорослий і кожна третя дитина. За даними ВООЗ, під час сезонних епідемій, викликаних різними вірусами грипу, у світі щороку помирають від 250 до 500 000 (більшість з них у віці старше 65 років), причому в деякі роки кількість смертей може сягати мільйона. Пандемії грипу виникають кожні 30-40 років і характеризуються високими показниками захворюваності та смертності.
В даний час існують різні противірусні препарати для лікування грипу. Їх можна розділити на три групи: етіотропні - інгібітори нейрамінідази (осельтамівір, занамівір, перамівір), блокатор іонного каналу, утвореного білком М2 (Ремантадин, Альгірем), інгібітори NP-білка (Інгавірін), інгібітор гемаглютиніну (Арбідол); препарати інтерферону (рекомбінантні альфа/гамма-інтерферони); індуктори інтерферонів (Кагоцел, Аміксин, Циклоферон). Найбільш ефективна противірусна терапія, розпочата в перші 24-48 годин від початку захворювання, яка дозволяє істотно скоротити тривалість лихоманки та інших клінічних симптомів захворювання.
Саме тому необхідність точної та своєчасної діагностики грипу не викликає сумнівів. На сьогоднішній день в клінічній практиці найчастіше використовується метод прямої імунофлуоресценції (ІФ) і, набагато рідше, метод полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР).
Як відомо, метод ІФ запропонував А. Кунс ще в 1941 р Реакція ІФ заснована на зв'язуванні антигену з антитілом, кон'югованим з флуоресцентною міткою (флуорохромом, наприклад, флюоресцеіна ізотіоціонатом (FITС), тетраметілродамін ізотіоціонатом (TRITC ) та ін.). Сьогодні для проведення цієї реакції використовують як поліклональні сироватки, так і моноклональні антитіла. Облік результатів реакції здійснюється за допомогою люмінесцентного мікроскопа, в оптичну систему якого встановлюється набір світл...
