клі кількість синтезованих копій фрагмента ДНК подвоюється.
Всі реакції проводять в пробірках, занурених у термостат. Зміна температурного режиму і його підтримку здійснюється автоматично.
Щоб зрозуміти, як саме відбувається ампліфікація певного сегмента ДНК в ході ПЛР, потрібно чітко уявити становище всіх праймерів і комплементарних їм послідовностей в ампліфіціруемого ланцюгах в кожному раунді. У першому раунді кожна з новосинтезованих ланцюгів має набагато більшу довжину, ніж відстань від 3 -гідроксільной групи її праймера до кінцевого нуклеотиду послідовності, комплементарної друге праймеру. Такі ланцюги називають довгими матрицями raquo ;, саме на них буде йти подальший синтез.
У другому раунді двухцепочечную ДНК, що складається з подібною і новосинтезованих (довга матриця) ланцюгів, знову піддають денатурації, а потім отжигают з праймерами. Під час синтезу в цьому раунді знову синтезуються довгі матриці raquo ;, а також деяку кількість ланцюгів з праймером на одному кінці і з послідовністю, комплементарної другий праймеру, на іншому ( короткі матриці ). Під час третього раунду всі гетеродуплекси, що утворилися раніше, одночасно піддаються денатурації і відпалу з праймерами, а потім реплицируются. У наступних раундах коротких матриць стає все більше, і до 30-го раунду їх число вже в 10 6 разів перевищує число вихідних ланцюгів або довгих матриць raquo ;.
Кількість специфічного продукту реакції (обмеженого праймерами) теоретично зростає пропорційно 2 n, де n - число циклів реакції. Насправді ефективність кожного циклу може бути менше 100%, тому в дійсності:
~ (1 + E) n,
де Р - кількість продукту, Е - середня ефективність циклу.
Кількість довгих копій ДНК теж зростає, але лінійно, тому в продуктах реакції домінує специфічний фрагмент. Зростання необхідного продукту в геометричній прогресії обмежений кількістю реагентів, присутністю інгібіторів, освітою побічних продуктів.
ПЛР - високочутливий метод, тому при наявності в досліджуваному зразку навіть мізерної кількості ДНК, що випадково потрапила з однієї реакційної суміші в іншу, можуть бути отримані хибнопозитивні результати. Це змушує ретельно контролювати всі використовувані для ПЛР розчини та посуд.
Основні принципи підбору праймерів.
При створенні ПЛР-тест-системи одним з основних завдань є правильний підбір праймерів, які повинні відповідати ряду критеріїв:
. Праймери повинні бути специфічні. Особливу увагу приділяють 3'-кінців праймерів, т.к саме з них починає добудовувати комплементарную ланцюг ДНК Taq-полімераза. Якщо їх специфічність недостатня, то, ймовірно, що в пробірці з реакційною сумішшю відбуватимуться небажані процеси, а саме, синтез неспецифічної ДНК (коротких або довгих фрагментів). Вона видно на електрофорезі у вигляді тяжких або легких додаткових смуг. Це заважає оцінці результатів реакції, т.к легко переплутати специфічний продукт ампліфікації з синтезованою сторонньої ДНК. Частина праймерів і дНТФ витрачається синтез неспецифічної ДНК, що призводить до значної втрати чутливості.
. Праймери не повинні утворювати димери і петлі, тобто не повинно утворюватися стійких подвійних ланцюгів в результаті відпалу праймерів самих на себе або один з одним.
2. Cтадіі постановки ПЛР
2.1 Підготовка проби біологічного матеріалу
Для виділення ДНК використовують різні методики залежно від поставлених завдань. Їх суть полягає в екстракції (витягу) ДНК з біопрепарату і видаленні або нейтралізації сторонніх домішок для отримання препарату ДНК з чистотою, придатною для постановки ПЛР.
Стандартної і тепер класичною вважається методика отримання чистого препарату ДНК, описана Мармурена. Вона включає в себе ферментативний протеоліз з подальшою депротеїнізацією і переосажденіем ДНК спиртом. Цей метод дозволяє отримати чистий препарат ДНК. Однак він досить трудомісткий і передбачає роботу з такими агресивними і мають різкий запах речовинами, як фенол і хлороформ.
Одним з популярних в даний час є метод виділення ДНК. Цей метод заснований на використанні для лізису клітин сильного хаотропного агента - гуанидина тіоционату (GuSCN), і подальшої сорбції ДНК на носії (скляні намиста, діатомова земля, скляне молоко і. Т.д.). Після отмивок в пробі залишається ДНК, сорбированная на носії, з якого вона легко знімається за допомогою елюіруются буфера. Метод зручний, технологічний і придатний для підготовки зразка до ампліфікації. Проте можливі втрати ДНК внаслідок незворотною сорбції на носії, а також в процесі численних отмивок. Особливо велике значення ...
