омозкова рідини, навколоплідна, суглобова рідина, бронхоальвеолярний лаваж, сік простати, слина, сеча, харкотиння, слиз і інші біологічні виділення, біоптати. p> Паркан матеріалу проводиться в умовах процедурного кабінету відповідного профілю. Після забору проби якнайскоріше повинні бути доставлені в ПЛР-діагностичну лабораторію. p> Паркан зразків необхідно проводити за допомогою стерильного, бажано одноразового, інструментарію тільки в одноразові стерильні пластикові пробірки або в скляні пробірки, попередньо оброблені протягом години хромової сумішшю, ретельно промиті дистильованою водою і прожарені в сушильній шафі при температурі 150 В° С протягом 1 години.
1. Виділення ДНК з клінічного зразка проводиться будь-яким способом. Основна вимога - досить стандартний вихід продукту і наінтактною, збереження двухнитевой структури.
Проведенню ПЛР передує стадія виділення та преципітації ДНК з досліджуваного матеріалу. Це забезпечує концентрування виявленої ДНК інфекційного агента в мінімальному об'ємі рідини, використовуваної в ПЛР. У випадках, коли не потрібно досягнення високої чутливості аналізу, наприклад, при ідентифікації МБТ після первинного культивування, достатня їх обробка, що дозволяє лише зруйнувати мікробну стінку: нагрівання в лизирующие буфері, ультразвукова обробка або використання ферментів (лізоцим) без подальшого виділення ДНК. p> За відсутності в пробі інгібіторів Taq-полімерази (гемоглобіну або інших) і наявності десятка копій ДНК-матриці в обсязі, внесена в пробірку з сумішшю всіх реагентів ПЛР, підготовка проби може бути повністю виключена. Наприклад, вірус гепатиту В в сироватці крові і багато збудники інфекційних менінгітів у спинномозковій рідини можна детектувати методом ПЛР без будь-якої підготовки, без попереднього виділення з них ДНК. У більшості випадків з досліджуваної проби крові, сироватки, лейкоцитів, біоптатів, сечі, мокротиння для виключення хибнонегативного результату слід виділити ДНК тим чи іншим способом. Завдяки цьому відбувається концентрування досліджуваної ДНК-матриці в малому обсязі та видалення інгібіторів Taq-полімерази. p> В даний час використовується кілька способів підготовки зразка для проведення ПЛР. Процедура підготовки проби включає лізис мікроорганізму і екстракцію нуклеїнової кислоти. З метою руйнування клітини використовують просте кип'ятіння, заморожування-відтавання в присутності лізоциму, а також спеціальні лизирующие буфери, що містять детергенти та протеіназу. Вибір методу диктується природою мікроорганізму, а точніше - природою його клітинної стінки. p> Для екстракції ДНК використовують два основні методи. По-перше, застосовують класичну процедуру фенольно-хлороформно екстракції. При цьому досягається хороша очищення ДНК і, в першу чергу, від інгібіторів Taq-полімерази, але неминучі великі втрати нуклеїнової кислоти, особливо помітні при роботі із зразками невеликого обсягу з низькою концентрацією інфекційного агента. Інший спосіб, який застосовує...
