ться для очищення нуклеїнової кислоти, заснований на використанні сорбентів. Підготовка матеріалу з його використанням займає менше часу і простіша у виконанні, хоча не завжди може бути застосована, оскільки не гарантує видалення можливих інгібіторів.
2. Ампліфікація. Полімеразна ланцюгова реакція ДНК проводиться в спеціальному приладі (термоциклер або ампліфікаторі), який, згідно введеною програмою, змінює температуру в робочих комірках, тримає її протягом заданого часу і переходить до наступного етапу.
Кожен цикл ПЛР зазвичай складається з трьох температурних режимів.
а) Нагрівання до 95 В° С протягом 30-40 сек. При цьому виділені молекули ДНК піддаються денатурації, тобто відбувається поділ ДНК на дві нитки.
б) Охолодження до оптимальної температури (зазвичай 48-66 В° С). При цьому розділення нитки ДНК можуть назад возз'єднатися по комплементарним ділянкам. Однак, за наявності у зразку цільових ділянок ДНК, синтетичні ДНК-зонди (праймери, довжиною 15-30 п.н.) специфічно зв'язуються (Гибрідизуючою) з комплементарними ділянками ДНК, наприклад хламідії або герпесвірусу. Тим самим обмежуються шукані ділянки генів, визначаючи точки початку і закінчення передбачуваного продукту ПЛР. Час відпалу 20-60 сек. p> в) Після завершення гібридизації праймерів з шуканими ділянками ДНК, температуру суміші підвищують до 72 В° С. Ця температура оптимальна для ферменту Таq ДНК-полімерази, яка починає швидко добудовувати одну й іншу ланцюжок ПЛР-продукту, починаючи з місця фіксації, відповідно, одного і другого ДНК-зонда. Цей процес називається елонгацією (тобто подовженням) ПЛР-продукту, самі ж продукти ПЛР іменують амплікони. Час протікання синтезу - 20-40 сек. p> При першому циклі ПЛР виходить деяке число амплікон різної довжини, які служать субстратом у другому циклі реакції, де кількість специфічних продуктів подвоюється ще раз. У кожному з наступних циклів (всього до 35-40) відбувається дворазове зростання числа цільових продуктів ПЛР-амплікон.
Специфічність ПЛР і кількість ампліфіціруемого ДНК, яка визначає чутливість, можуть значно варіювати в Залежно від концентрації і якості 5 основних компонентів реакційної суміші (ДНК-матриці, Taq-полімерази, праймерів, дезоксинуклеозидтрифосфатов (dNTP) та іонів Mg) і температурного режиму ПЛР. p> Навіть за оптимальних концентраціях ферменту, іонів Mg, праймерів і dNTP специфічність і чутливість ПЛР дуже сильно залежить від температури відпалу праймерів (2-я стадія циклу ПЛР): неспецифичность ПЛР-ампліфікації підвищується при зниженні температури відпалу нижче оптимальної і при підвищенні концентрацій праймерів і dNTP вище оптимальних, а при підвищенні температури відпалу вище оптимальної знижується вихід специфічної ампліфіціруемого ДНК аж до її повного зникнення. p> 3. Детекція. p> Способи обліку результатів ПЛР:
Якісна оцінка (електрофоретичний метод)
У багатьох випадках при ПЛР-діагностики достатньо отримати від...
