методом радиоавтографии дає нам можливість локалізувати на хромосомі місця з певною нуклеотидної послідовністю або навіть розташування певних генів. Для цього розчин з міченої нуклеїнової кислотою наносять на препарат з денатуруючої ДНК у складі хромосом або ядер. У процесі ренатурації ДНК утворюється гібрид меченной нуклеїнової кислоти і комплементарним ділянкою вихідної ДНК. Місце такого зв'язку реєструється радіоавтографіческі. Також метод застосовується при фарбуванні нуклеїнової кислоти флуорохромами. Це означає, що ми можемо визначити положення будь-якій послідовності ДНК.
2. Електронна мікроскопія
Оскільки питання підвищення дозволу завжди стояло гостро, вчені прийшли до висновку, що в світлової мікроскопії підвищити дозвіл можна тільки за рахунок використання джерела світла, який випускає хвилі з найменшою довгою. Таким джерелом може бути розпечена нитка, що викидає потік електронів, який можна сфокусувати, пропускаючи через магнітне поле. На основі цього був створений світловий мікроскоп. В даний час розрізняють трансмісійний електронний мікроскоп (ПЕМ) і растрову електронну мікроскопію (РЕМ). Далі будуть розглянуті методи електронної мікроскопії.
. 1 Контрастування корпускулярних об'єктів
Існує кілька методів контрастування. Я розгляну два з них: негативний контрастування і оттенение металами. Негативний контрастування роблять за допомогою ФВК, молібденовоскіслого амонію, уранілацетатом. після нанесення розчину на досліджуваний об'єкт, потім нанести на плівки-підкладки і висушити, то досліджуваний об'єкт буде занурений в аморфну ??речовину високою пліт?? ості. Це призведе до того, що на знімках вони будуть виглядати як білі об'єкти на темному фоні. Розчини можуть також проникати вглиб досліджуваного об'єкта і виявляти приховані структури. Також існує метод позитивного контрасту. У цьому випадку використовуються солі важких металів, які підвищують електронну щільність об'єкта, таким чином, контраст його підвищується. Відтінення металами - при термічному випаровуванні металів їх частинки розлітаються і осідають на досліджуваному об'єкті у вигляді шару, чия товщина варіюється залежно від напрямку польоту частинок. У місцях, де екранує пучок частинок, простір буде темніше.
2.2 Ультрамікротомія
Ультрамікротомія являє собою сукупність прийомів для отримання надтонких зрізів за допомогою ультратомов, або ультрамікротомов. Ультрамікротоми - апарати для автоматичного приготування надтонких зрізів тканин запрограмованої товщини (5-10 нм). Це потрібно, тому що пучок електронів, проходячи через більш товсті об'єкти, поглинається, викликає нагрівання і призводить до деформації препарату. Процедура їх задоволена схожа з аналогічною для світлової мікроскопії. Спочатку клітини фіксують, часто використовують ГА (глутаровий альдегід), а потім OsO 4, хоча буває і застосування їх окремо. Потім здійснюють проводку з останнім етапом - зануренням у ксилол. Після препарат заливають епоксидною смолами (Епон). Тепер препарат, укладений в тверді блоки можна різати за допомогою скляних або алмазних ножів для виготовлення зрізів настільки малої величини використовують термічну подачу об'єкта. Потім йде забарвлення препарату, звичайно уранілацетатом і нітратом свинцю, які контрастують позитивно. Ця техніка виготовлення відкрила величезні можливості для застосування електронної мікроскопії майже у всіх областях біології та медицини.
Можливо проводити дослідження методом радиоавтографии з використанням сверхтонкозерністих емульсій і величезних експозицій. А також досліджень без фіксації і ув'язнення в Епон методом кріоультрамікротоміі. У цьому випадку об'єкт моментально заморожують до температури рідкого азоту, вода переходить у склоподібний стан, а процеси моментально гальмуються. Отримані таким чином зрізи використовують в імунохімічних досліджень і т.д.
Для вивчення структури мембранних компонентів використовують метод заморожування-сколювання. Метод схожий на попередній: об'єкт моментально охолоджується до температури рідкого азоту, а потім сколюється охолодженим ножем. Поверхня шару покривають шаром металу і вуглецю, а потім розчиняють об'єкт і отримують репліку з поверхні відколу. При цьому можна досліджувати рельєф поверхні мембран.
. 3 Метод високовольтної мікроскопії
Прискорююча напруга такого мікроскопа складає 1-3 млн вольт. Така напруга дозволяє розглядати об'єкти більшої товщини (1-10 мкм), а використовую стереоскопічну зйомку, ми можемо отримати інформацію про 3D організації внутрішньоклітинних структур з високим дозволом.
. 4 Метод скануючої (растрової) електронної мікроскопії
При використ...
