стабільність, пов'язана з втратою хромосом.
До основних методів клонування клітин відносяться клонування методом лімітують розведень, клонування в напіврідкому агарі і клонування за допомогою приладу - проточного цитофлуориметр. Найбільш поширеним методом є клонування методом лімітують розведень.
) Напередодні готують 96-ти ямковий мікропланшети з живлячими клітинами з розрахунку одна Гібридома на один мікропланшет. Мікропланшети ставлять у вологий СО2-інкубатор з 5% СО2 при 37 ° С.
) Наступного дня готують дві суспензії гібридомних клітин в холодному середовищі з розрахунку 1 клітина в 100 мкл і 0,5 клітини в 100 мкл.
) Кожен 96-ти ямковий планшет ділять на дві частини і в кожні 48 лунок розподіляють одну й іншу клітинні суспензії одного клону гібридоми. Поміщають планшети в СО2-інкубатор.
) Через 10 - 14 днів перевіряють зростання колоній в мікропланшетах і відбирають ті, в яких колонії виросли в менш 30% лунок. Культуральні рідини з цих лунок тестують методом ІФА на присутність специфічних антитіл.
) Клітки з лунок, які дали позитивні результати, послідовно нарощують в 96-, 24-лункових чашках. Частина наросших клітин заморожують для збереження і подальшого використання. [1]
4. Очищення антитіл
Для багатьох цілей не потрібно очищення антитіл і вони використовуються у вигляді культуральних рідин. Грубу іммуноглобуліновой фракцію можна отримати висолюванням білків сульфатом амонію з наступним діалізом.
Одним з методів, що застосовуються для очищення антитіл є метод очищення на білок А - сефарозе.
) До 20 мл культуральної рідини при постійному перемішуванні додають по краплях 20 мл насиченого розчину сульфату амонію, рН 6,5. Суміш залишають на 1 год при 4 ° С і потім центрифугують.
) Супернатант відкидають, осад розчиняють у дистильованій воді в 1/20 початкового об'єму (1мл) та діалізу проти поточної води протягом 3 год, потім - проти двох змін фосфатного буфера, рН 8,0.
) 1,5 г білок А-сефарози суспендують у 0,1 М фосфатному буфері, рН 5,0, і заповнюють піпетку на 10 мл, взяту в якості колонки.
) Препарат отдіалізованних антитіл наносять на колонку і промивають її 25 мл уравновешивающего буфера. У випадку, якщо антитіла належать до підкласу IgG1, їх елюція проводять цитратним буфером, рН 6,0. Антитіла підкласів IgG2a і IgG3 елюіруют цитратним буфером, рН 4,5.
) Отримані препарати антитіл діалізу проти фосфатного буфера, рН 7,2, якщо потрібно, концентрують препарат антитіл до 2 - 5 мг/мл і зберігають при 4 ° С з додаванням 0,01% NaN3.
Для очищення імуноглобулінів класу М (IgM) застосовують метод гель-фільтрації на сефадексе G - 200. Для цього сухий сефадексе суспендують у 200-кратному об'ємі води і залишають стояти на 48 год при кімнатній температурі для повного набухання. У колонку розміром 2,5? 90 см вносять суспензію повністю набряклого гелю. Сефадексе в колонці дають відстоятися, потім з метою урівноваження та досягнення постійної висоти стовпа гелю колонку промивають 3 - 5 обсягами буферного розчину. Для перевірки рівномірності заповнення через колонку можна пропустити розчин пофарбованого білка, наприклад, цитохрому с або блакитного декстрану. При цьому пофарбована зона повинна бути компактною і рухатися по колонці паралельно її основи. Досліджувану білкову суміш розчиняють в буферному розчині (Тріс-HCl буфер - 0,1 М розчин, що містить 0,5 М NaCl, рН 7,8) і вносять в колонку. [4]
5. Визначення специфічності отриманих гібридом
Для визначення специфічності гібридом використовують, як правило, непрямий метод імуноферментного аналізу (ІФА) з використанням антивидових антитіл, кон'югованих з ферментної міткою. [5] Можна використовувати кон'югати кролячих антімишіних антитіл з пероксидазою, який готують наступним чином:
) 5 - 10 мг пероксидази з хрону розчиняють в 1 мл дистильованої води при легкому перемішуванні до кінцевої концентрації 5 мг/мл.
) До розчину ферменту додають 0,2 М водний розчин NaJO4 до кінцевої концентрації 0,016 М. При цьому розчин пероксидази міняє колір від золотисто-коричневого до зеленого. Інкубують в темряві при легкому перемішуванні протягом 20 хв.
) Процес окислення зупиняють додаванням етиленгліколю до кінцевої концентрації 0,16 М. суміш інкубують протягом 1 год і діалізу проти 1000-кратного обсягу ацетатного буфера при 4 ° С протягом 18-24 год.
) Розчин антитіл прогрівають при 56 ° С протягом 30 хв. Доводять рН розчину антитіл і модифікованої пероксидази до 9,5 бікарбонатним буфером.
