щити частоту проникнення ДНК в клітини, використовують метод електропорації, що полягає в короткому експонуванні клітин в інтенсивному електричному полі. Ця обробка створює порожнини в мембранах клітин, що сприяє кращому сприйняттю клітинами ДНК.
Після введення рекомбінантних молекул ДНК в бактерії останні висівають на МПА, збагачений антибіотиками для селекції бажаних клітин, т. е. клітин, що містять рекомбінантні молекули ДНК. Частота трансформації є невисокою. Зазвичай один трансформант виникає на 106 висіяних клітин. Якщо ж вектор є фагів, то вдаються до трансфекції клітин (бактерій або дріжджів) фагом. Що стосується соматичних клітин тварин, то їх трансфекцію здійснюють ДНК у присутності хімічних речовин, що полегшують проходження ДНК через плазматичні мембрани. Можливі також прямі мікроін'єкції ДНК в овоцити жаб, в культивовані соматичні клітини і в ембріони ссавців.
Найважливішим моментом, пов'язаним з молекулярним клонуванням, є пошук способу, що дозволяє встановити, чи дійсно клонируемого фрагмент включився в вектор і разом з вектором, утворивши рекомбинантную молекулу ДНК, увійшов до клітки. Якщо мова йде про бактеріальних клітинах, то один із способів заснований на обліку инсерционно інактивації плазмідної (векторного) гена резистентності. Наприклад, в Плазмідний векторі pBR322, детермінує резистентність до ампіциліну і тетрацикліну, єдиний сайт для рестріктази Pst I знаходиться в локусі, займаному геном резистентності до ампіциліну. Pst I -плавленіе на цьому сайті генерує липкі кінці, що дозволяють лігування клонируемого фрагмента з векторною ДНК. Однак при цьому плазмідний (векторний) ген ампіцилін-резистентності інактивується, тоді як ген тетрациклін-резистентності на векторі залишається інтактним. Саме, ген тетрациклін-резистентності і використовується для селекції клітин, трансформованих рекомбінантними молекулами ДНК. Щоб переконатися, що клітини виросли колоній на середовищі з тетрацикліном дійсно містять рекомбінантні молекули ДНК, їх перевіряють за допомогою так званого «спот-тесту» на парі чашок з щільним середовищем, одна з яких містить ам-піціллін, тоді як інша позбавлена ??цього антибіотика. Клонують ДНК містяться лише в трансформанта, резистентних до тетрацикліну (рис. 228). Що стосується трансформантов, резистентних одночасно до ампіциліну і тетрацикліну (АРТС), то вони містять плазмідні (векторні) молекули, які спонтанно придбали кільцеву форму без включення до них чужорідної (клонують) ДНК. Інший спосіб виявлення інсерції чужорідних (клонують) фрагментів в плазмідний вектор заснований на використанні вектора, що містить ген (3-га-лактозідази. Інсерція чужорідної ДНК в цей ген неминуче інактивує синтез р-галактозидаза, що може бути виявлено посівом трансформованих клітин на середу, яка містить субстрати р-галактозидази. Ця середу дозволяє селекцію забарвлених колоній клітин.
Як уже зазначено, рестрикційні лінійні фрагменти векторної ДНК здатні до відновлення кільцевої структури без включення до них клонують сегментів. Щоб зменшити частоту спонтанного утворення таких кільцевих молекул векторної ДНК, рестрікти векторної ДНК обробляють фосфатазою. У результаті цього освіту кільцевих молекул ДНК стає неможливим, оскільки будуть відсутні кінці 5'-РО ^, необхідні для дії лігази.
Сукупність колоній-трансформантов, які виросли на селективної середовищі, являє собою сукупність клітин, що містять клони різних фрагментів (генів) клонують геномної або до ДНК. Колекції цих клонів формують так звані бібліотеки ДНК, широко використовувані в генно-інженерних роботах.
Заключною стадією клонування генів є виділення і дослідження клонованої ДНК, включаючи секвенування.
Перспективні штами бактерій або соматичних клітин, що містять рекомбінантні молекули ДНК, які контролюють синтез цікавлять білків, що мають комерційну цінність, передають у промисловість.
3. Технологія виробництва водоростей Spirulina рlatensis і Spirulina maxima
Спіруліна (Spirulina platensis) - одноклітинна синьо-зелена водорість, одне з найдавніших на Землі рослин. Вік спіруліни оцінюють по-різному: від 700 млн. До 3,5 млрд років. Відкриття унікальних властивостей спіруліни як завжди сталося випадково. У 1964 році бельгійський ботанік Ж. Леонар виявив в африканських лісах поблизу озера Чад невелике плем'я аборигенів, уклад життя яких не змінювався протягом останніх кількох десятків, а може бути і сотень тисяч років. Ці мирні люди не займалися ні полюванням, ні землеробством. Все, що їм було необхідно, вони знаходили навколо себе - ці дикі ліси рясніють фруктами, ягодами, корінням і іншою їжею. Сучасна цивілізація їм була незнайома.
Свою ходу спіруліна (Spirulina platensis) почала з Африки - населення району озера Чад давно вживає її в їжу, називаючи це...
