"justify">) Розчини негайно об'єднують, вносячи розчин імуноглобулінів по крапля, і інкубують суміш при кімнатній температурі в темряві протягом 2 год при безперервному легкому перемішуванні.
) Додають NaBH4 з розрахунку 1мг NaBH4 на 1 мг пероксидази і інкубують ще 2 год при тій же температурі. Діаліз проти 1000-кратного об'єму 0,01 М фосфатного буфера.
ІФА проводять наступним чином.
) У лунки мікропланшетів вносять розчин антигену в концентрації 1 мг/л і інкубують протягом 1 год при 37 ° С. Потім мікропланшети інтенсивно відмивають фосфатним буфером, що містить 0,05% твіну - 20.
) Блокування неспецифічних місць зв'язування проводять 1% -ним розчином бичачого сироваткового альбуміну (БСА) по 100 мкл в лунку і інкубують протягом 1 год при 37 ° С.
) БСА інтенсивно відмивають фосфатним буфером з твіном - 20 і в лунки вносять по 50 мкл культуральної рідини. Мікропланшети інкубують, ретельно відмивають і вносять по 50 мкл кон'югату кролячих антитіл.
) Після інкубації Незв'язана кролячі антитіла відмивають і вносять субстрат АБТС (2,2? - азіноді- (3-етілбензтіазолін - 6-сульфонат) - 2NH4). Реакцію зупиняють через 30 хв додаванням 1 до 1н сірчаної кислоти.
) Визначають величину оптичного поглинання на спектрофотометрі при 452 нм. В якості позитивного контролю беруть сироватку мишей, які були імунізовані даним антигеном і селезінки яких використовували для злиття. В якості негативного контролю беруть культуральне середовище з лунок, які не дали зростання клонів. [4]
6. Застосування моноклональних антитіл
Найбільш широко використовуються моноклональні антитіла в медичній діагностиці. Якщо до антитілами приєднати радіоактивні або магнітоактивного матеріали і ввести їх в живий організм, то можна виявити в ньому патологічні зони. Такі моноклональні антитіла приєднуються до уражених хворобою клітин організму, а відповідні індикаторні матеріали дозволяють з'ясувати їх місцезнаходження. [6]
Моноклональні антитіла використовуються і в процесах очищення речовин. Сучасні технології засновані на приєднанні антитіл до твердої матриці носія. До них додають суміш молекул, що містить шуканий антиген. Потім комплекси антиген - антитіло відмиваються від домішок, не пов'язаних з матрицею. Після руйнування ковалентних зв'язків антиген - антитіло в розчині залишаються вільні антигени. [7]
Якщо отримати антитіла певного типу і імунізувати ними тварина, то утворюються анти-антитіла. Вони можуть бути використані для стимуляції імунної системи. На цьому принципі грунтується отримання вакцин нового типу. Набори моноклональних антитіл можуть бути також призначені для боротьби з алергенами.
Завдяки високий специфічності моноклональні антитіла широко використовуються як зондів для точного визначення природи молекул поверхні клітин і клітинних органел. З їх допомогою також можна проводити детекцию активності ферментів. [6]
Методи імуноферментного аналізу застосовують в діагностиці вірусних захворювань рослин. Це дозволяє скоротити час отримання безвірусного садивного матеріалу, відбирати нові вірусоустойчівость сорту. При генно-інженерних експериментах можна швидко відбирати клони - продуценти. [8]
Нові можливості застосування моноклональних антитіл в терапії інфекційних і пухлинних захворювань дає їх кон'югація з токсичною речовиною. Завдяки виборчому властивості антитіл зв'язуватися тільки з певною кліткою, остання може бути знищена за допомогою токсину або випромінювання. [2]
Висновок
Моноклональні антитіла є перспективним методом в імунології, що дозволяє вести діагностику та лікування інфекційних і пухлинних захворювань. Крім того, моноклональні антитіла знаходять широке застосування в біохімії, де використовуються для точного визначення природи молекул поверхні клітин і клітинних органел.
Моноклональні антитіла отримують шляхом злиття клітин мишачої мієломи з В-лімфоцитами, що виробляються клітинами селезінки імунізованих миші. Отримання моноклональних антитіл таким методом включає в себе наступні етапи: імунізацію тваринного шляхом введення необхідного антигену; приготування суспензії клітин селезінки; злиття клітин мієломи з клітинами селезінки з утворенням гібридом; клонування гібридом. Очистку антитіл проводять за допомогою гель-фільтрації на сефадексе G - 200, або на білок А-сефарози.
Для виявлення специфічності отриманих гібридом використовують метод імуноферментного аналізу.
Отримані таким чином моноклональні антитіла, оскільки є мишачими і синтезують мишачий імуноглобулін, нерідко викликают...
