ітин, які перетворять крохмаль у сахарозу. Він також збільшує площу поверхні, подвергаемую впливу ферментів під час розрідження або сахарообразованія. Зазвичай це збільшує швидкість і вихід дріжджового бродіння та інших перетворювальних процесів.
· Обертання лопаті або поршня
Блендери, як правило, мають ріжучі лопаті, що обертаються з великою швидкістю. Кількість і конструкція цих лопатей бувають різними, але всі вони зазвичай загострені під прямим кутом один до одного, а форма їх забезпечує хороше перемішування вмісту посудини. Суспензію клітин поміщають в спеціальний стакан, який має по всій висоті розтруби і в поперечному перерізі виглядає як лист конюшини. Для підтримки низької температури в процесі гомогенізації стакан поміщають в лід. Завдяки особливому розташуванню лопатей і конструкції склянки в ході фракціонування виникають гідродинамічні сили. Метод досить універсальний і широко застосовується для фракціонування клітин, однак слід мати на увазі, що при швидкому обертанні лопатей гомогенізаторів виникають деякі небажані ефекти.
Більшість гомогенізаторів преставляют собою прилад, що з маточки з ручним (гомогенізатори Даунса і Тёнбрека) або механічним (гомогенізатор Поттера-Ельвегёйма) приводом, який обертається або рухається вгору і вниз в скляному циліндричній посудині. Необхідно стежити за тим, щоб зазор між товкачиком і стінками посудини залишався постійним, так як швидкість руйнування клітин залежить не тільки від швидкості обертання маточки, а й від співвідношення між радіусами маточки і судини. Посудина закріплюється нерухомо, тому швидкість обертання суспензії змінюється від мінімальної у його стінок до максимальної у поверхні маточки. Отже, чим менше відстань між цими поверхнями, тим вище градієнт швидкості. Виникаючі при високих швидкостях сили достатні для руйнування досить тонких мембран клітин тварин. Рослинні і бактеріальні клітини при цьому не руйнуються.
· Балістична руйнування
Терміном балістичне руйнування позначають різноманітний набір методів, в яких бактерії руйнуються силами зсуву, що розвиваються, коли суспензія клітин дуже сильно струшується або перемішується разом з маленькими скляними або пластмасовими кульками
Раніше широко застосовувалися два пристрої - апарат Мікле для струшування і апарат для струшування, насаджував на вісь центрифуги типу International. Ні в одному з них не забезпечувалося підтримання низької температури під час струшування, і тому доводилося часто переривати процес для охолодження проби. Ці пристрої більше не випускаються промисловістю, вони замінені тканинним дезінтеграторах Брауна (Braun MSK; В. Braun Melsungen Apparatebau, Melsungen, Federal Republic of Germany), який поставляється в США багатьма фірмами, що спеціалізуються на випуску лабораторного обладнання. Дезинтегратор Брауна має контейнер для проби об'ємом 65 мл, який гойдається в горизонтальній площині з частотою 2000-4000 коливань/хв. Охолодження забезпечується струменем рідкого СО2, що спрямовується до контейнера з пробою. У більшості випадків клітини руйнуються за 3-6 хв при температурі нижче 4 ° С.
Дезинтегратор Брауна застосовують, якщо потрібно виділити клітинні стінки і окремі ферменти з грампозитивних бактерій. Як правило, при цьому користуються методикою Ворку: суспензію клітин (30 мл з вмістом сухої речовини 20-50 мг/мл) у відповідному буфері змішують з 20 мл кульок Ballotini №12 у відповідному контейнері (для повітря важливо залишити ні менше 20% обсягу ємності ) і протягом 0,5 хв для охолодження контейнера через апарат пропускають СО2. Потім протягом 3,5-5 хв залежно від типу клітин пробу струшують з частотою 3000 рухів за хвилину. Кульки видаляють низькошвидкісним центрифугуванням або пропусканням суміші через грубий скляний фільтр. Деякі дослідники вважають за краще використовувати замість скляних кульок пластмасові, щоб звести до мінімуму денатурацію ферментів. Якщо описану вище методику застосовують для виділення клітинних стінок, то пробу після струшування негайно піддають обробці, що забезпечує інактивацію автолітіческіх ферментів.
· Заморожування-відтавання
Заморожування - відтавання використовують для того, щоб зробити грамнегативні клітини чутливими до лізоциму або детергентам. Цей метод можна застосовувати при виділенні мембран або внутрішньоклітинних органел у великих кількостях.
Для виділення великих кількостей мембран корисна наступна методика. Густу суспензію відмитих клітин (клітини складають близько 30% об'єму суспензії) в 0,02 М трис-буфері, pH 7,8, що містить 5 мМ ЕДТА, 0,25 М сахарози і 0,5 мг/мл лізоциму, поміщають в колбу і заморожують у вигляді тонкого шару, обертаючи колбу в ацетонової бані з сухим льодом. Потім суспензію розморожують, занурюючи колбу в теплу воду, і, як ті...
