льки все розтане, виливають вміст в 20 обсягів холодного буфера, що має склад: 0,02 М трис, 0,5 мМ MgCl2, 0,1 мг/мл дезоксирибонуклеази, pH 7 , 8. Суміш негайно обробляють близько 20 с в ножовому мікроізмельчітеле, щоб подрібнити ДНК і зруйнувати клітини.
неруйную клітини видаляють центрифугуванням протягом 5 хв при 5000 g. Якщо осаду багато, його знову суспендують у зазначеному вище розчині трис-ЕДТА-сахарози і повторюють цикл заморожування - відтавання з подальшим розведенням.
· Продавлювання за допомогою преса
Продавлювання за допомогою преса являє собою, ймовірно, найпоширеніший і найкорисніший метод руйнування клітин. Деяка кількість бактеріальної суспензії (обсягом 5-40 мл з вмістом клітин до 30 об.%) Поміщають в сталевий циліндр з щільно пригнаним поршнем, що має маленький випускний клапан з вузьким отвором; з клапаном з'єднана виводить трубка. Циліндр з поршнем ставлять під 10-тонний гідравлічний прес. У міру того як поршень опускається, клітини руйнуються великими гідродинамічними силами, що виникають при проходженні клітинної суспензії через отвір випускного клапана. У цього методу є ряд переваг.
По-перше, немає проблеми з охолодженням, так як циліндр і поршень преса охолоджують заздалегідь, а нагрів відбувається тільки при проходженні клітин через отвір клапана. Температура витікаючої рідини підвищується на 5-10 ° С, але цю рідину можна швидко охолоджувати, якщо збирати в металеву пробірку або склянку, поміщені в крижану баню.
По-друге, руйнування відбувається практично миттєво, і суспензія зруйнованих кліток не піддається додатковим гідродинамічним впливів, які могли б зашкодити субклітинні частинки.
По-третє, при використанні гідравлічного преса задовільної якості можна проводити експерименти в добре відтворюваних умовах. До того ж на ступінь руйнування не впливає щільність клітинної суспензії, фаза зростання, в якій були зібрані клітини, або середу, в якій клітини суспендировані.
Установка типу преса Френча складається з циліндра, поршня, випускного клапана і подає навантаження станини (American Instrument Co. [Aminco], Rockville, MD.). У старих моделях цього преса використовували що швидко зношується клапан зі сталевою голкою, який часто ушкоджувався під час роботи. Замість нього можна використовувати випускається зараз клапан з підігнаним за розміром нейлоновим кулькою (Aminco). Він дозволяє поршню доходити до дна циліндра, не викликаючи ушкоджень, і забезпечує більш однорідне руйнування. Зручний також гідравлічний прес з приводом від мотора; прес можна встановлювати на постійне зусилля в діапазоні швидкостей руху поршня (Aminco; або Enerpac, Inc., Butler, Wis.).
Клітинну суспензію завантажують в циліндричну осередок і поміщають під гідравлічний прес. Поршень преса опускається на поршень осередки, поки не розвинеться максимальне зусилля. До цього моменту випускний клапан закритий, а потім його повільно відкривають доти, поки поршень не піде повільно вниз. Перед руйнуванням клітини збирають, відмивають один раз і суспендують в обсязі буфера [0,01 м HEPES (М - 2-гідроксіетілпіперазін-М '- 2-етансульфоновая кислота), pH 7,4 при 0 ° С], що становить 0,1 обсягу взятої культури. Додають трохи панкреатичної рибонуклеази і дезоксирибонуклеази (0,1 мг/мл) і руйнують суспензію на пресі Френча під тиском 14-107 Па. Після руйнування додають MgCl2 до кінцевої концентрації 1 мМ і видаляють неруйную клітини центрифугуванням при 5000 g протягом 5 хв. Mg2 + потрібен для того, щоб функціонувала дезоксирибонуклеаза; його додають після руйнування, щоб запобігти стабілізацію рибосом.
· Осмотический шок.
Осмотический шок - це пошкодження або розпад клітин, викликані приміщенням їх у гіпотонічну або гіпертонічну середу. Застосовується для дезінтеграції клітин, що мають Маломіцні і високопроніцаемого клітинну оболонку. При цьому відбувається сольовий шок, оболонка клітин, органел, вірусів розривається тиском води, проникаючої всередину клітини. Клітини суспендують в буферній гіпертонічної середовищі, що містить ЕДТА, потім швидко переносять в охолоджену гіпотонічну середу (на льоду), центрифугують, надосадок зливають. ЕДТА додають з метою зруйнувати ліпополісахариди клітинної стінки. Осмотический шок у деяких бактерій настає при перенесенні теплою культури в холодний розріджувач.
· Декомпресія
Для безперервної дезінтеграції мікроорганізмів запропоновані способи, засновані на принципі декомпрессионной дезінтеграції. Сутність способу полягає в тому, що клітини мікроорганізмів попередньо насичують газом під тиском до вирівнювання парціального тиску з обох сторін оболочечного бар'єру, а потім переводять клітини в зону нормального тиску. В результаті виникає градієнт тиску, спрямован...
