и 3000 об/хв, після чого надосадову рідину зливають у чисті пробірки.
Вимірюють екстинкцію дослідної роботи проти контрольної на спектрофотометрі при 264 нм в кюветі з товщиною шару 1 см.
Для побудови калібрувального графіка в сім пронумерованих пробірок вносять компоненти, перераховані у наведеній нижче таблиці, у зазначених кількостях.
Для приготування робочого розчину уроканіновой кислоти беруть її вихідний 0,001 М розчин і розбавляють в 10 разів дистильованою водою.
Доводять об'єм всіх проб до 3 мл дистильованою водою, додають в усі пробірки по 1 мл розчину трихлороцтової кислоти, перемішують вміст. Центрифугують проби 5 хв при 3000 об/хв, надосадову рідину зливають у чисті пробірки і вимірюють екстинкцію, як зазначено вище. p align="justify"> № № пробиРабочій розчин уроканіновой кислоти, млПірофосфатний буфер, млАктівірующій розчин, млРаствор гістидину, млСодержаніе уроканіновой кислоти в пробі,
Розрахунок роблять за формулою
Е200
х = -----,
2
де х - активність гістідази в сироватці крові, мкмоль/(ч? л);
Е - вміст уроканіновой кислоти в пробі, знайдена за калібрувальним графіком, мкмоль;
- коефіцієнт перерахунку на 1 л сироватки крові;
- коефіцієнт перерахунку на 1 ч.
Оформлення роботи. За отриманими екстинкція розрахувати активність гістідази в сироватці крові, порівняти її з нормою і вказати причини можливих відхилень. p align="justify"> Практичне значення роботи. Гістідаза міститься переважно в печінці і шкірі людини і відноситься до органоспецифічних для них ферментам. При ураженні цих органів, головним чином печінки, спостерігається надходження цього ферменту в кров. У нормі активність гістідази в сироватці крові визначається у вигляді слідів приблизно у 1-2% здорових пацієнтів. Лише у грудних здорових дітей реєструється активність цього ферменту в сироватці крові. При захворюваннях печінки в сироватці крові виявляється гістідазная активність, причому ступінь її збільшення характеризує тяжкість патологічного процесу. br/>
Робота 59. Визначення вмісту вільного гідроксипроліну у сечі по Нейману і Логану в модифікації П.М. Шараева
Реактиви. Сульфат міді (II), 0,01 М розчин; пероксид водню, 6%-ний розчин; сірчана кислота, 6 М розчин; реактив Ерліха (5%-ний розчин n-диметиламінобензальдегіду в н-пропанол або ізопропанолі); гідроксид натрію, 2,5 М розчин.
Обладнання. Штатив із пробірками; піпетки місткістю 1 мл, скляні палички; термостат, вода з льодом (або снігом) у склянці; водяна баня; ФЕК. p align="justify"> Матеріал. Сеча, попередньо профільтрована. p align="justify"> Метод заснований на взаємодії продукту окислення і декарбоксилювання гідроксипроліну з n-диметиламінобензальдегідом, в результаті чого утворюється забарвлене з'єднання рожевого кольору. Інтенсивність забарвлення пропорційна концентрації гідроксипроліну в пробі. p align="justify"> Хід роботи. У дві пробірки вносять по 1 мл профільтрованої сечі, розчину сульфату міді (II), розчину гідроксиду натрію і розчину пероксиду водню. Вміст обох пробірок перемішують скляною паличкою протягом 5 хв, потім їх ставлять у термостат при 70? С на 5 хв, періодично струшуючи до повного припинення виділення бульбашок. Потім проби охолоджують у воді з льодом або снігом. До охолодженим пробам доливають по 4 мл розчину сірчаної кислоти і по 2 мл реактиву Ерліха і перемішують вміст пробірок скляною паличкою. Після цього дослідну пробірку поміщають в киплячу водяну баню на 80 с, а контрольну - на той же час у воду з льодом або снігом. p align="justify"> Вимірюють екстинкцію дослідної та контрольної проб проти води на ФЕК при зеленому світлофільтрі в кюветі з товщиною шару 1 см. З екстинкції дослідної проби віднімають екстинкцію контрольної проби і отриману величину використовують для знаходження змісту гідроксипроліну в пробі за калібрувальним графіком .
Для побудови калібрувального графіка відмірюють в одну пробірку 1 мл води (В«сліпаВ» проба), а в п'ять інших (стандартні проби) - по 1 мл розчину гідроксипроліну з концентрацією його 1, 10, 15, 20 і 25 мкг/мл.
Далі проби обробляють як і, як і описані вище досвідчені, вимірюють екстинкцію стандартних проб проти В«сліпоїВ» при тих же умовах.
Розрахунок роблять за формулою
ЕV
х = -----,
1000
де х - вміст гідроксипроліну у сечі, мг/добу;
Є - зміст гідроксипроліну в пробі, знайдена за калібрувальним графіком за різницею екстинкції дослідної та контрольної проб, мкг; - добовий об...
