, особливо при некрозах, активність катепсинов в сироватці крові збільшується. Це явище відзначено за інфаркті міокарда, причому ступінь підвищення ферментативної активності в сироватці крові залежить від глибини і поширеності некротичного вогнища у серце. br/>
Робота 57. Визначення активності аспартат-і аланін-амінотрансферази в сироватці крові по Райтманом і Френкелю
Реактиви. Субстратні розчини № 1 і № 2 *; 2,4-дінітрофенілгідразін, 0,1%-ний розчин на 2 М розчині соляної кислоти; гідроксид натрію, 0,4 М розчин. p align="justify"> Обладнання. Штатив із пробірками; піпетки місткістю 0,2; 1 і 5 мл; водяна баня; ФЕК. p align="justify"> Матеріал. Сироватка крові. p align="justify"> Метод заснований на визначенні піровиноградної кислоти, яка є одним з продуктів реакції, що каталізується Аланінамінотрансфераза, або продуктом декарбоксилювання оксалацетата, що утворюється в реакції, що каталізується Аспартатамінотрансфераза. Новоутворена піровиноградна кислота визначається по кольоровій реакції з 2,4-дінітрофенілгідразіном (див. роботу 31). p align="justify"> Хід визначення. Визначення активності ферментів проводять за схемою
Послідовність операцийАлАТАсАТопытконтрольопытконтрольВнесение субстратних растворовРаствор № 1 - 0,5 млРаствор № 1 - 0,5 млРаствор № 2 - 0,5 млРаствор № 2 - 0,5 млНагреваніе5 хв при 37? С5 хв при 37? сдобавленіем 2,4 - ДНФГ-1, 0 мл-1, 0 млДобавленіе сивороткі0, 1 мл0, 1 мл0, 1 мл0, 1 млІнкубація30 хв при 37? С60 хв при 37? сдобавленіем 2,4-ДНФГ0, 5 мл-0, 5 мл-Експозіція20 хв при 18-20? С20 хв при 18-20? сдобавленіем гідроксиду натрія5, 0 МЛ5, 0 МЛ5, 0 МЛ5, 0 млЕкспозіція10 хв при 18-20? С10 хв при 18-20? З
Фотометрують досвідчені проби проти контрольної на ФЕК при 500-560 нм (зелений світлофільтр) в кюветі з товщиною шару 1 см.
Розрахунок роблять за формулами:
m10000? 2
х (АСТ) = ---- або х (АлАТ) = ----,
1000 1000
де х - активність ферментів, ммоль/(год? л); - кількість піровиноградної кислоти в пробі, знайдена за калібрувальним графіком (рис. 9), мкмоль;
- коефіцієнт перерахунку на 1 л сироватки;
- коефіцієнт перерахунку мкмоль в ммоль;
- для перерахунку на 1 ч.
В
Практичне значення роботи. У нормі активність аланінамінотрансферази становить 0,1-0,68, а аспартатамінотрансферази 0,1-0,45 ммоль/(год? Л). p> Ухвала активності АсАТ і АлАТ і їх відносини широко використовується в клінічній практиці для виявлення патологічних процесів в різних органах. У міокарді більш висока активність АсАТ, ніж АлАТ, в печінці зворотне співвідношення активності цих ферментів. При інфаркті міокарда значно збільшується активність АсАТ в сироватці крові з одночасним підвищенням коефіцієнта АсАТ/АлАТ. При ураженні печінки (цироз, сироватковий гепатит тощо) більш виражено підвищується активність АлАТ і знижується коефіцієнт АсАТ/АлАТ. br/>
Робота 58. Визначення активності гістідази в сироватці крові по Табору і Мелером в модифікації В.А. Буробіна
Реактиви. L-гістидину моногідрохлорид, 0,2 М розчин (418 мг на 100 мл), доведений за допомогою 1 М розчину NaOH до рН 8,2; пірофосфатной буфер, 0,1 М розчин з рН 8,2 *; трихлороцтової кислота, 20 %-ний розчин; активує розчин, що містить відновлений глутатіон і альбумін *; уроканіновая кислота, 0,001 М розчин для побудови калібрувального графіку (8,7 мг дигідрату уроканіновой кислоти розчиняють в 0,001 М розчині NaOH в мірній колбі місткістю 50 мл).
Обладнання.
Штатив з пробірками; піпетки місткістю 1 і 5 мл; водяна баня з лабораторним термометром; термостат, відрегульований на 37? С; центрифуга з Центрифужна вагами; спектрофотометр.
Матеріал. Сироватка крові. p align="justify"> Метод заснований на вимірюванні екстинкції уроканіновой кислоти, що утворюється з гістидину під дією гістідази, в зоні її максимального поглинання при 264 нм в кислому середовищі.
Ферментативна реакція протікає за рівнянням
В
Хід роботи. У дві пробірки - контрольну і дослідну - вносять по 0,3 мл пірофосфатная буфера, по 0,5 мл досліджуваної сироватки і за 1 мл активуючого розчину. В дослідну пробірку доливають 1 мл розчину гістидину і доводять об'єм проби до 3 мл дистильованою водою. Перемішують вміст струшуванням. p align="justify"> Обидві пробірки поміщають на 2 год у водяну баню або термостат при 37 Вє С, потім додають в пробірки по 1 мл розчину трихлороцтової кислоти.
Після цього в контрольну пробу підливають 1 мл активуючого розчину, обсяг її доводять до 3 мл дистильованою водою і перемішують вміст струшуванням.
Проби центрифугують 5 хв пр...
