. 3.2 Ідентифікація генів icl 1 і icl 2
В результаті застосування оптимізованої методики виділення з використанням фенол-хлороформно екстракції була проведена екстракція сумарною клітинної РНК з насіння арабидопсиса. У ході виділення в якості хаотропного агента був використаний гуанидин-изотиоцианат. Застосування даного з'єднання дозволило отримати високоочищені препарати недеградірованной РНК з рослинних клітин, що було встановлено шляхом проведення аналітичного електрофорезу в 1% агарозному гелі (рис. 4). На наведеній електрофореграмме результатів типового виділення видно, що кількість 28S рРНК переважає над 18S рРНК, що свідчить про відсутність деградації препарату під дією РНКаз. Крім того, в отриманих препаратах відсутні домішки геномної ДНК, що є важливою умовою успішного проведення подальших маніпуляцій з виділеною РНК і дозволяє отримувати достовірні і відтворювані результати при вимірюванні концентрації розчинів РНК та проведенні полімеразної ланцюгової реакції.
Рис. 4. Електрофорез сумарною клітинної РНК з насіння арабидопсиса, в 1% агарозному гелі в присутності бромистого етидію.
Для синтезу першого ланцюга комплементарної ДНК використовувалася рекомбінантна зворотна транскриптаза вірусу Moloney лейкозу мишей M-MuLv. Даний фермент складається тільки з однієї субодиниці і проявляє 5? 3 праймер-залежну полімеразну активність, ефективну тільки відносно матриць РНК [15]. В якості затравочного праймера використовувався оліго- (dT) 20 праймер.
Використання даного праймера дозволяє вибірково перевести в форму ДНК тільки молекули інформаційної РНК, що представляють собою транскрипти працюючих генів. Застосування в реакційній суміші інгібітора РНКаз IRNasine [6] дозволило уникнути деградації матриць РНК під час протікання реакції і отримати набір компліментарних ДНК (рис. 5). Отримані в ході зворотної транскрипції продукти використовувалися далі для проведення полімеразної ланцюгової реакції.
Рис. 5. Продукти зворотної транскрипції сумарною клітинної РНК насіння арабидопсиса з використанням ревертази M-Mulv і оліго- (dT) 20 праймера.
Зворотній транскрипція виділеної РНК і подальший ПЛР-аналіз кДНК з праймерами для icl1 і icl2 генів ізоцітратліази показали наявність двох смуг на гель-електрофорезі (рис. 6), що свідчить про експресії цих генів. Аналіз банку даних GeneBank показав, що в геномі арабидопсиса ізоцітратліаза кодується двома генами, розташованими в різних хромосомах.
Рис. 6. Результати ПЛР на матриці кДНК з використанням праймерів для генів icl1 і icl2.
Отримані результати показують, що в геномі арабидопсиса, на стадії проростання насіння експресуються одночасно два гени ізоцітратліази.
Експресія двох генів в насінні арабидопсиса пов'язана з тим, що в період проростання клітини зародка потребу у великій кількості енергії і матеріалу для біосинтетичних процесів. На початкових етапах проростання насіння здійснюють гетеротрофний тип харчування, використовуючи в якості субстратів запасні речовини. У тому числі, здійснюється процес перетворення запасних жирів у вуглеводи через гліоксилатний цикл, який є ланкою глюконеогенезу.
При проростанні насіння арабидопсиса відбувається інтенсифікація процесів утилізації запасних речовин, у тому числі ліпідів, що, ймовірно, пов'язано з індукцією глиоксилатного циклу. Так поява активності ізоцітратліази в перший день проростання і поступове її збільшення до максимуму на 4 день свідчить про активну утилізації ліпідів.
Вивчення, що включало виділення сумарної клітинної популяції РНК і проведення зворотної транскрипції, отримання комплементарної ДНК і ЗТ-ПЛР аналіз, показало, що в ході проростання насіння арабидопсиса експресуються обидва гени ізоцітратліази - icl1 і icl2.
Таким чином гліоксилатний цикл може мати більш універсальне поширення в організмах ніж вважалося раніше. При цьому даний метаболічний шлях не функціонує протягом усього онтогенезу, а індукується на певних стадіях і виконує ключову роль у мобілізації запасного пулу жирних кислот.
Висновки
. Вивчено динаміку активності ІЦЛ при проростанні насіння арабидопсиса і показано, що досліджуваний фермент має максимальне значення активності на 4 день проростання. Ймовірно, в даний період здійснюється активна утилізація запасних ліпідів через глюконеогенез.
2. Застосування оліго- dT праймера в якості затравки при проведенні реакції зворотної транскрипції, дало можливість отримати набір кДНК до матричної РНК з насіння арабидопсиса, придатних для подальших аналізів.
3. Методом З...
