stify"> Метою роботи була ідентифікація генів ізоцітратліази в проростаючих насінні арабидопсиса.
Для досягнення мети були поставлені наступні завдання:
. Вивчити динаміку активності ізоцітратліази в насінні арабидопсиса.
. Виділити сумарну клітинну РНК з проростає насіння арабидопсиса.
. Методом зворотної транскрипції отримати кДНК з РНК об'єкта дослідження.
. Провести ПЛР аналіз кДНК з насіння арабидопсиса для ідентифікації генів ІЦЛ.
. 2 Об'єкти та методи дослідження
. 2.1 Об'єкт дослідження
В якості основних об'єктів дослідження в роботі використовували 4-денні насіння Arabidopsis thaliana L., вирощені гідропонним способом при 25 ° і інтенсивності світла 25 Ватт/м 2.
2.2.2 Методи дослідження
Визначення активності ізоцітратліази
Вимірювання активності ізоцітратліази проводилося спектрофотометричним методом при довжині хвилі 324 нм на СФ - 46 в кюветах з товщиною шару 1 см протягом 5 хвилин при 25 о С. Коефіцієнт екстинкції ( ? при 324) склав 1,7 мМ - 1 см - 1. Спектрофотометрірованіе проводили в середовищі колориметрування з додаванням 20 мкл гомогенату.
Активність ізоцітратліази вимірювали спектрофотометрично по збільшенню оптичної щільності при 324 нм. Середа колориметрування містила 50 мМ Tris-HCl (pH 7,5); 1 мМ ізоцитрат калію; 5 мМ MgCl 2; 4 мМ фенілгідразин солянокислий. Даний метод заснований на утворенні комплексу фенілгідразину з гліоксілатом, що поглинає при 324 нм (рис.3).
За одиницю ферментативної активності брали кількість ферменту, що перетворює 1 мкмоль субстрату за одну хвилину при 25 о С і оптимальному значенні рН.
Загальна кількість білка визначали за методом Лоурі [27]. Оптичну густину розчинів визначали на спектрофотометрі СФ - 46 (ЛОМО, Росія) при 750 нм.
Сумарну клітинну РНК виділяли методом фенол-хлороформно екстракції [8] з наступними модифікаціями. Для інгібування РНКаз на стадії отримання клітинного лізата використовували 42,6% гуанидин тиоцианат. Очистку РНК проводили за допомогою осадження хлоридом літію. Якісний аналіз препаратів РНК проводили шляхом неденатурірующего електрофорезу в 1% (в/о) гелі агарози при напруженості електричного поля 7 В/см. Фарбування гелю вироблялося 0,1% водним розчином бромистого етидію. Візуалізація результатів проводилася з використанням трансілюмінатора з довжиною хвилі 312 нм. Результати фіксувалися цифровою відеокамерою Samsung і оброблялися за допомогою пакету програм Gel Explorer 1.0.
Зворотну транскрипцію проводили з використанням ревертази RevertAid M-MuLV (Fermentas, Литва) згідно з рекомендаціями фірми-виробника. Для проведення зворотної транскрипції використовували 1 мкг сумарної клітинної РНК. В якості затравочного використовувався оліго- (dT) 20 праймер. Для запобігання деградації матриць РНК в реакційну суміш вносилося 20 од. інгібітора РНКаз IRNasine.
Для ідентифікації генів ізоцітратліази використовували специфічні праймери, розроблені із застосуванням програмного забезпечення FastPCR (Фінляндія). Послідовності праймерів для гена icl 1: прямий 5 -atcgcacacccacttacctc - 3 і зворотний 5 -ttcccctagagcgtttctga - 3 (T m=57 ° С). Послідовності генспеціфіческіх праймерів для icl 2: прямий 5 -atcgaggacgagtgg - 3 і зворотний 5 -gtcccagtcccagac - 3 (T m=58 ° С). Полімеразну ланцюгову реакцію [23] проводили в термоціклёрах Biometra (Biometra, Німеччина) і «Терцик» (ДНК-Технологія, Росія). Дослідження результатів полімеразної ланцюгової реакції проводили за допомогою електрофорезу в 1% агарозному гелі в присутності 0,1% етідіумброміду. Розмір продуктів визначали шляхом порівняння з маркерами ДНК відомої довжини (СібЕнзім, Росія).
. 3 Результати та їх обговорення
. 3.1 Динаміка активності ізоцітратліази
Вимірювання активності ізоцітратліази в насінні арабидопсиса протягом 10 днів показало, що вона індукується з перших днів проростання і досягає максимального значення вже на четверту добу. Зростання активності ІЦЛ свідчить про інтенсифікацію глиоксилатного циклу.
Рис. 3. Динаміка активності ізоцітратліази з насіння арабидопсиса.
Активне функціонування глиоксилатного циклу приводить до зменшення вмісту жирних кислот в насінні і збільшенню кількості цукрів та їх похідних. Спочатку йде активне запасання цукрів, яке змінюється їх споживанням в період інтенсивного проростання. У міру зниження концентрації жирних кислот, відбувається зменшення активності ІЦЛ.
...
