ти життєздатність клітини і цитотоксичні ефекти. Сполуки, що володіють цитотоксичність, часто викликають порушення цілісності клітинної мембрани, що можна встановити за допомогою вітального фарбування трипановим синім або йодидом пропідія, які вільно проникають через пошкоджену мембрану і забарвлюють внутрішньоклітинні компоненти, але в здорових клітинах відсутні [18]. Цілісність мембран може бути оцінена іншим способом - шляхом визначення лактатдегідрогенази, що має в нормі внутрішньоклітинну локалізацію, у зовнішньому середовищі [19]. Цитотоксичність може також бути визначена з використанням MTT тесту, заснованого на здатності мітохондріальних дегідрогеназ конвертувати водорозчинний 3- (4,5-діметілтіазол - 2-іл) - 2,5-дифеніл - 2Н-тетразоліум бромід (МТТ) в формазану. Подібний тест, заснований на окислювально-відновному потенціалі, був розроблений із застосуванням флуоресцентного барвника - діазорезорціна. На додаток розроблений тест in vitro з АТФ в якості маркера життєздатності [20].
Доведено неоднакова чутливість до наночасток різних ліній клітин, що обов'язково слід враховувати при оцінці цитотоксичності наночастинок.
Таким чином, иисследовании цитотоксичності може включати:
. Визначення пошкодження мембран;
підрахунок за допомогою світлової мікроскопії пошкоджених і загиблих клітин, пофарбованих барвником (наприклад, трипановим синім), пасивно вступникам всередину;
спектрофотометричне визначення живих клітин, активно захоплюючих барвник (наприклад, нейтральний червоний);
лізис клітин з вивільненням внутрішньоклітинних ферментів (наприклад, ЛДГ) в культуральне середовище, спектрофотометричне визначення (доступні діагностичні набори).
. Вивчення внутрішньоклітинних метаболічних змін;
визначення активності ферментів I і II фази біотрансформації за допомогою спектрометрії, мас-спектрометрії, газової хроматографії, високоефективної рідинної хроматографії та ін.;
визначення в МТТ-тесті порушення функції мітохондрій;
визначення вмісту АТФ у клітинах.
. Вивчення процесів апоптозу, що викликає ряд біохімічних і морфологічних змін, що визначаються кількісно;
каспазной активності (зокрема, каспаз - 3);
експресії Apaf - 1, Bcl - 2 протеїнів Bax і Bid, p53.
Вивчення запальних ефектів наноматеріалів на різних культурах клітин людини in vitro необхідно для оцінки потенційної токсичності наночасток. Цитокіни, хемокіни поряд з іншими маркерами запалення часто дозволяють отримати уявлення про механізм дії та токсичності наноматеріалів. Використання відповідних типів клітин людини має критичне значення.
Показано, що наночастинки здатні проникати в клітини, минаючи будь-які бар'єри. Вони здатні до трансцитозу через епітеліальні і ендотеліальні клітини, поширюються по ходу дендритів і аксонів нервів, циркулюють в кровоносних і лімфатичних судинах, мають тропність до певних тканин. Побоювання з приводу надходження наноччастіц в клітини, пов'язане з впливом на здоров'я людини і навколишнє середовище, спонукало ісследовтелей оцінювати здатність наноматеріалів проникати через клітинні мембрани у внутрішньоклітинні компартменти і ядро. Щоб оцінити ризик, важливо визначити спосіб впливу і вирішити, чи здатні дані наночастинки проникати через мембрани клітин. Переміщення можна реєструвати за допомогою конфокальної флюоресцентної мікроскопії, трансмісійної електронної мікроскопії.
Через унікальних властивостей і активності, наноматеріали можуть перетинати клітинні мембрани, вбудовуватися в ДНК, пошкоджувати білки. Як тільки вхідні ворота для наноматеріалів визначені, культури клітин відповідних тканин можна вивчати відносно пошкодження протеїнів і ДНК. Слід віддавати перевагу культурам клітин людини.
Серед методів in vitro, застосовних для вивчення генотоксичности/мутагенності наноматеріалів: тест Еймса, тест на хромосомні аберації, тест на позаплановий синтез ДНК, тест на сестринський хроматидні обмін.
Кожен з тестів може бути частковою або повною заміною для методів in vivo. Негативні результати тесту не вимагають проведення додаткових досліджень in vivo. Крім того, генотоксичность можна оцінювати, використовуючи інші доступні, надійні методи, наприклад, Cоmet тест.
Таким чином, досягнення у галузі високих технологій, аналітичних методів дозволяють проводити адекватне тестування токсичності без використання тварин. Електронна мікроскопія і клітинні культури, діагностичні набори надають дослідникам можливість оцінювати клітини/органели/ДНК в ході токсикологічних досліджень і реєструвати хімічні зміни в цих структурах, викликан...
