і наноматеріалами.
З погляду безпеки для здоров'я людини і навколишнього середовища необхідно, щоб нанотоксикології будувалася на фундаменті надійних, адекватних тестів in vitro, що дозволяють прогнозувати ефект наноматеріалів.
2. Об'єкти, методи досліджень, прилади, обладнання
2.1 Наночастки, використовувані в експериментах in vitro
. 1.1 Характеристика наночастинок срібла
Для проведення досліджень використані наночастинки срібла виробництва фірми Aldrich, зміст наночастинок срібла 99,5% (слідові кількості металів), розмір часток lt; 100 нм. Частинки мають органічне покриття для дисперсії в полярному розчиннику.
2.2 Культури клітин, використовувані для вивчення токсичності in vitro
2.2.1 Культура клітин карциноми легені людини (А549)
Клітини культивують в середовищі ДМЕМ з додаванням 10% -ой інактивованої телячої ембріональної сироватки (FBS), 45 ОД/мл пеніциліну і 45 мг/мл стрептоміцину в 5% -ої CO 2 середовищі при 37 ° C в CO 2 -інкубаторе (малюнок 2).
Малюнок 4 - Культура клітин А549
2.2.2 Культура клітин амніону людини, субліній FL
Морфологія: епітеліоподобная. Спосіб культивування: моношаровий. Умови культивування: середа - 199 або ЕМЕМ, сироватка - ВРХ 10% (199); ембріональна бичья10% (ЕМЕМ). Процедура пересіву - Cнятие клітин, використовуючи версію 0,02% c хімопсін 0,1 мг/мл, кратність розсіву 1: 4 - 1:10, оптимальна щільність 0,5-1,0х105 клітин/мл. Каріологія: 2n=46, межі мінливості по числу хромосом 47-66, модальне число хромосом 60, кількість маркерів 9, з яких 3 - специфічні для клітин НеLa (N 1,2,3, G диски). Ізоензими Г6ФДГ, А.16. Чутливість до інтерферону людини. Область застосування: вірусологія, канцерогенез, клітинна біологія.
. 2.3 Культура лімфоцитів людини
Культура лімфоцитів людини є однією з обов'язкових тест-систем при оцінці впливу мутагенних факторів навколишнього середовища. Одним з достоїнств цієї тест-системи є те, що по спостережуваних типам аберацій можна досить виразно ідентифікувати тип мутагенного впливу.
Культивування лімфоцитів. Кров відбирають з ліктьової вени, поміщають в стерильну пробірку, що містить розчин гепарину (200 ОД/мл крові). У стерильних умовах зразки крові переливають по 0,8 мл в приготовані для культивування флакони Карреля з культуральної середовищем. Склад культурального середовища: 6,16 мл середовища МЕМ; 1,6 мл інактивованої телячої сироватки; 0,08 мл L-глютамина; 0,08 мл розчину антибіотика; 0,15 мл фитогемагглютинина. Флакони поміщають у термостат при 37 ° С для інкубації клітин протягом 48 ч. Для блокування мітозу на стадії метафази за 2 год до закінчення інкубації у флакони додають розчин демеколціна в концентрації 0,2 мкг/мл середовища.
Гіпотонізація клітин. Після закінчення культивується?? вання культуру клітин переливають у центрифужні пробірки і центрифугують при 10007 об./хв протягом 15 хв для осадження клітин. Надосадову рідину видаляють за допомогою водоструминного насоса, додають попередньо підігрітий до 37 ° С гіпотонічний розчин (0,75 М KCl) і ресуспендіруют в ньому осад. Далі пробірки з культурою клітин витримують на водяній бані (37 ° С) 10-12 хв. По закінченні гіпотонізаціі знову центрифугують при тих же умовах з подальшим видаленням надосадової рідини.
Фіксація клітин. Для фіксації клітин осад ресуспендіруют в 1-1,5 мл свіжоприготованого фіксатора (суміш метилового спирту і крижаної оцтової кислоти в пропорції 3: 1) на шейкері і доводять його обсяг до 10 мл. Зміну фіксатора з подальшим центрифугуванням виробляють тричі.
. 2.4 Культура кардіоміоцитів щурів лінії SHR
Вихідний матеріал для первинної культури кардіоміоцитів щурів отримують шляхом дезагрегації 0,25% -ним розчином трипсину при 37? С протягом 30 хв серцевої тканини 12-14-добових ембріонів щура. Після видалення трипсину осад суспендують в ростовий середовищі (90% середовища Голка, 10% ембріональної сироватки телят з додаванням антибіотиків). Суспензію пропускають через капронову фільтр (комірка 0,3 х 0,3 мм). Після підрахунку в камері Горяєва клітини висівають у 96-ямковий планшети і культивують в ростовий середовищі DMEM.
. 3 Методи вивчення цитотоксичності наноматеріалів в культурах клітин ссавців
2.3.1 Метілтетразоліевий тест
МТТ-тест призначений для виявлення метаболічних порушень, а саме порушень функції мітохондрій, що відображають вплив на життєздатність клітин. Клітини вирощували в СО2-інкубаторі (Herra Cell) при 37 ...
