тійним помішуванням на хитною платформі. Мембрану промивають TBST 5 разів по 5 хв.
Обробка кон'югатом з пероксидазою хрону. Проводиться аналогічно обробці кон'югатом з лужною фосфатазою.
Прояв реакції.
Нанесення субстратної суміші для індикації лужної фосфатази. Мембрану поміщають на 5 хв в 50 мл люмінесцентного буфера. Розчиняють 100 мкл CDP-Star (12,5 мМ, 50-кратний концентрат) в 5 мл люмінесцентного буфера. Мембрану поміщають на скло, на її поверхню наносять 5 мл розчину CDP-Star, розподіляють його рівномірно по всій поверхні мембрани і інкубують 5 хв при кімнатній температурі. З поверхні мембрани видаляють субстрат за допомогою м'якої тканини. На мембрану в темряві або при червоному світлі накладають рентгенівську плівку, поміщають в світлонепроникну касету і витримують при кімнатній температурі приблизно 5 хв. Рентгенівську плівку проявляють і проводять інтерпретацію отриманих результатів.
Нанесення субстратної суміші для індикації пероксидази хрону. Реакція візуалізується шляхом нанесення на мембрану субстратної суміші (розчин діамінобензідіна 0,5 мг/мл і перикиси водню 0,5 мг/мл у фосфатному буферному розчині pH 7,4) до появи смуг . Реакція зупиняється промиванням мембрани водою. Після висушування мембрани на повітрі проводиться облік результатів.
Фосфатний буферний розчин 0,1 М, рН 7,4:
NaCl 8,0 гKH 2 PO 4 0,2 г Na 2 HPO 4 2,8 г KCl0, 2 Гводі дистильована До 1000 мл
Облік та інтерпретація результатів
При використанні кон'югату з лужною фосфатазою . Контрольний зразок дає на рентгенівській плівці темну лінію в районі 32-35 kDa, негативні проби не дають сигналу, або спостерігається темна рисочка протеїнази К в районі 31 kDa, позитивні проби дають темну лінію в районі 27-30 kDa.
При використанні кон'югату з пероксидазою . Після обробки субстратної сумішшю мембрана набуває світло-коричневе забарвлення за рахунок взаємодії з субстратної сумішшю неспецифічно пов'язаного з мембраною кон'югату. Маркери молекулярної маси видно у вигляді білих смуг на світло-коричневому тлі. Контрольний зразок дає на мембрані темну лінію в районі 32-35 kDa, негативні проби не дають специфічного сигналу у вигляді темної лінії, спостерігається світла рисочка ...
