сендвіч поміщають в пластикову касету, закривають її і поміщають в камеру для блотингу. Касету слід вставляти таким чином, щоб PVDF-мембрана була звернена до позитивного полюса, а гелі - до негативного (мал. 9).
блотинг проводять при 150 V протягом 1 години при +4 В° С при постійному охолодженні.
Забарвлення білків . Мембрану видаляють і забарвлюють пов'язані з нею білки за допомогою Ponceau S. Потім мембрану промивають буфером TBST до зникнення червоного забарвлення.
Склад буфера TBST:
NaCl8, 0 гKCl0, 2 гТріс3, 0 гДістіллірованная вода до 1000 млТвін-200, 5 мл буфера TBST доводять до 7,4 за допомогою соляної кислоти.
Обробка антитілами.
Блокування . Для блокування неспецифически зв'язуючих ділянок мембрани її інкубують з блокуючим буфером (5% розчин сухого молока в фосфатному буфері) протягом 0,5 години при кімнатній температурі з постійним помішуванням на хитною платформі.
Обробка першими антитілами . Після блокування неспецифически зв'язуючих ділянок мембрани на неї наносять сироватки, специфічні до пріонів білка. Для цього використовують:
поліклональні антисироватки до тканин мозку великої рогатої худоби;
- моноклональні антитіла - 6Н4, SAF 70, F89/160.1.5.
Застосування поліклональних антитіл знижує чутливість реакції і її специфічність через наявність у ній антитіл до тканин мозку, які взаємодіють з незруйнованими протеїназою До окремими білками мозку великої рогатої худоби.
Для постановки реакції більш ефективно використовувати моноклональні антитіла. Для цього 10 мкл мишачих моноклональних антитіл розчиняють у 50 мл TBST (розведення 1: 5000). В отриманий розчин антитіл поміщають мембрану і інкубують при кімнатній температурі протягом 1 години (або 12-18 годин при +4 В° С) з постійним помішуванням на хитною платформі. Мембрану промивають TBST 3 рази по 5 хв.
детекції реакції можна проводити шляхом використання антімишіних антитіл, мічених лужною фосфатазою або пероксидазою хрону.
Обробка кон'югатом з лужною фосфатазой.1 0 мкл антитіл козла проти імуноглобулінів миші, мічених лужною фосфатазою розчиняють у 50 мл TBST (розведення 1: 5000). В отриманий розчин антитіл поміщають мембрану і інкубують при кімнатній температурі протягом 0,5 години з пос...
