Клітини Обережно переносячи на середовище для Подальшого культівування та регенерації.
За помощью біолістічної Гарматій були протрансформовані однодольні рослини, Такі, як кукурудза, рис, пшениця, ячмінь. При цьом були отрімані стабільні рослини - трансформанта. Крім Успіхів в отриманні трансгенних однодольних, біолістічна трансформація застосовується для прямого перенесення ДНК в ембріогенній пилянь и Подальшого Швидкого Отримання трансгенних дігаплоїдніх рослин, Які є Важлива етапом у селекційній работе. У Сейчас годину ЦІМ методом булу проведена трансформація рослин Тютюна и после регенерації гаплоїдніх рослин отрімані стабільні трансформанта [8].
. 1 Трансформація листових дисків Тютюна
У багатьох випадка при культівуванні рослинної тканини легше регенеруваті Пагоні з експлантатів ОРГАНІВ, чем з отриманий на Основі протопластів тканин або усталеніх (адаптованості) калусніх культур. Онкогенні область т-ДНК у багатьох широко вікорістовуваніх Неонкогенні векторах А. tumefaciens замінена на домінантній селективних маркерних ген неоміцінфосфотрансферазі (NPT). Неоміцінфосфотрансфераза фосфорілює І, таким чином, інактівує антибіотик неоміцін/канаміцін, Який в нормі токсичності для клітін Вищих рослин. Трансформовані Клітини в місці пораненному, что експресують ген NPT, можна відбіраті на СЕРЕДОВИЩА, що містять антибіотик. У ІНШОМУ випадка експланті, что інокулюються, можна помістіті на середовище для регенерації пагонів. Пагоні розвіваються безпосередно з трансформованості клітін з невеликим Додатковий Утворення калуса. Агробактерії відаляють путем ОБРОБКИ антібіотікамі, Які нетоксічні для рослинних клітін, такими, як цефотаксим.
Листові диски, отрімані від рослин, что розмножуються in vitro або теплично, особливо зручні для експеріментів з трансформації пасльоновіх, например Nicotiana tabacum, Petunia hybrida и томатів, а такоже Деяк других сімейств. При культівуванні на відповідніх СЕРЕДОВИЩА Листові диски Швидко переходять до формирование калуса в області зрізаніх країв експлантів, особливо там, де смороду знаходяться у контакті з СЕРЕДОВИЩА. Если Такі експланті помістіті безпосередно на середовище для регенерації пагонів, то течение короткого проміжку годині (10-15 днів) около зрізаніх країв з'являються Пагоні разом Із супутнім калуса. Середовища, Які стімулюють регенерацію з листового дисків, зазвічай відрізняються високим відношенням цітокінінів до ауксину.
Описана нижчих методика трансформації предполагает использование листових дисків Nicotiana tabacum. Важлива відзначіті, что зрізі листових пластинок Тютюна НЕ містять бруньки або качани ОРГАНІВ І, отже, більшість пагонів, что формуються у краю зрізу, походити з дедіференціювання клітін, чутлівіх до трансформації агробактерій. Много других тіпів експлантів містять меристеми або бруньки и могут основном продукуваті зачатки пагонів з меристем камбію або других Глибока шарів клітін експлантів, Які нечутліві до Агробактерії [9].
. 1.1 Методика Отримання трансформованості пагонів
) Поміщають молоді, листя Тютюна, что Повністю розпустивши, в плоский стерильний посуд и заливають 10% -вим Розчин миючий засобими Domestos. Обережно, Щоб не пошкодіті листя, відаляють всі бульбашки з поверхні листя путем Обережним помішування стерильним шпателем и залішають на 15 хв.
) Ретельно споліскують 4 рази на 400 мл стерільної води.
) Працюючий на стерільній білій кахельній плітці, відаляють всі білі, пошкоджені при стерилізації ділянки листя и СЕРЕДНЯ жилку, а потім розрізають лист на квадрати площею 0,5-1 см 2 с помощью стерильного скальпеля. Ріжучій інструмент слід регулярно стерілізуваті, занурюючі в спирт и обпікаючі в полум'ї пальника. Перед тім як розрізаті експланті, інструменти та патенти охолодіті. Готують достаточно Кількість матеріалу, щоб отріматі 200 шматочків листа, однак, щоб избежать вісіхання НЕ слід нарізаті відразу весь материал. Досить за один раз нарізаті шматочкі листа на 2-3 чашки. Поміщають по 10-12 шматочків аркуша на шкірні з 20 чашок з СЕРЕДОВИЩА Мурасіге-Скуга (MS) i герметизують чашки Липки стрічкою. Інкубують чашки течение 2 діб при 24-26 ° С і нізької освітленості (2000 люкс, фотоперіод 16 рік).
) Експеримент Включає Такі контролі:
Контролі (8 чашок). Поміщають по два неінокульованіх контролі на шкірні з ніжчепереліченіх СЕРЕДОВИЩА :; MS + цефотаксим (Cх); MS + канаміцін (Km); MS + Cx + Km;
) Інокуляції (12 чашок). Поміщають шматочкі листа в розведения 1:50 суспензію нічної культури відповідного штам агробактерій, струшують надлишок Рідини и поміщають їх на віхідну чашку з MS. Обмотують краю чашки Липки стрічкою и інкубують (24-26 ° С) при слабкій освітленості (2000-4000 люкс) ще 2-4 дні. <...
