ива з з'явилися приладнати для виготовлення мікропіпеток діаметром 0,1-0,5 мікрона и мікроманіпулятора. Так, плазміді, що містять фрагмент вірусу герпесу з геномом тімідінкіназі (ТК) i плазміду рВR322, були ін єкційовані в ТК-Клітини и Було показано, что ТК-ген проник в ядра и нормально в них репліціювався. Методи введення ДНК помощью мікроін єкцій БУВ розроблення на качана 70-х років Андерсоном и Діакумакосом. В принципі, за наявності хорошого устаткування можна за 1 годину ін єкціюваті 500-1000 клітін, причому в кращих експеримент в 50% клітін спостерігається стабільна інтеграція та експресія ін'єктованіх генів. Перевага описування методу Полягає такоже у тому, что ВІН дозволяє вводіті будь-яку ДНК в будь-які Клітини, и для Збереження в клітінах введеного гена НЕ нужно Ніякого селективного тиску.
Електропорація заснован на того, что імпульсі вісокої напруги оборотно збільшують пронікність біомембран. У середовище для електропорації додаються Клітини и фрагменти ДНК, Які необходимо ввести в Клітини. Через середовище пропускають вісоковольтні імпульсі (напряжение 200-350 В), что прізводять до Утворення пір (електропробій) в цітоплазматічній мембрані, годину Існування и розмір якіх достатні, щоб Такі макромолекул, як ДНК, могли Із зовнішнього середовища Войти в клітіну в результате Дії осматічніх сил. При цьом про єм Клітини збільшується.
Напруженість електричного поля и длительность его Дії при концентрації, что трансформує ДНК и реціпієнтні Клітини для кожної системи клітін підбірають експериментально, з тім щоб досягті високого відсотка поглінання ДНК виживання клітін. Показано, что в оптимальних условиях електропорації Кількість трансформантів может досягаті 80% клітін, что вижили.
Електропорація - фізичний, а не біохімічній метод, и це, мабуть, обумовлює его Широке! застосування. Чісленні дослідження продемонструвалі, что електропорація может успішно використовуват Для введення молекул ДНК в Різні тіпі клітін, Такі як культівовані Клітини тварин, найпростіші, дріжджі, бактерії и протопластах рослин. Електропоріюючій ефект високовольтне розряду на бішарову ліпідну мембрану, мабуть, поклади від радіуса ее кривизни. Тому дрібні Бактеріальні Клітини Ефективний поглінають ДНК при значний більшій напрузі (10 кВ/см и более), чем Великі Тварини і рослинні Клітини, ефективна поглінають ДНК при напруженості поля 1-2 кВ/см.
Електропорація - найбільш простий, Ефективний и відтворюваній методів введення молекул ДНК в Клітини. Проти до недавнього годині цею метод вікорістовувався в ограниченной чіслі лабораторій у зв'язку з відсутністю серійніх приладів - електропораторів. З'явилися и вдосконалення таких приладів в ексклюзивний дводенний роки прізведе до широкого! Застосування даного підходу в генетічній інженерії самих різніх тіпів клітін.
Міні-Клітини отримуються путем Блокування Донорний клітін мітозі кольцемідом. При трівалій обробці клітін кольцемідом в них вокруг кожної хромосоми формується нова ядерна мембрана. Обробка цитохалазином В і центрифугування виробляти до Утворення міні-клітин, что представляються мікроядра, інкапсульовані в цитоплазматичного мембрану.
Отрімані міні-Клітини очень чутліві до різного роду вплівів, того для злиттів підбірають СПЕЦІАЛЬНІ м'які умови. Метод важкий, прімхлівій, ефективність низька - 10-6 - 10-7.
Ліпосомі - сферічні Оболонков, Які складаються з фосфоліпідів. Отримуються їх путем різкого струшування суміші водного Розчин и ліпідів, або обробляючі ультразвуком водні емульсії фосфоліпідів. Ліпосомі, что складаються з фосфатидилсерину и холестерину найбільш прідатні Для введення ДНК в Клітини Тварини і рослин. Системи перенесеного помощью ліпосом нізькотоксічні по відношенню до клітін [6, 7].
Метод біологічної балістікі (біолістікі) є одним з найбільш ефективних на сьогоднішній день методів трансформації рослин, особливо однодольних.
Суть методу Полягає в тому, что на найдрібніші частинки вольфраму, діаметром 0,6-1,2 мкм, напілюється ДНК вектор, что містіть необхідну для трансформування гену конструкцію. Вольфрамові частинки, что несуть ДНК, наносячи на целофановой підкладку и поміщаються всередину біолістіческой Гарматій. Калуса або суспензія клітін наноситися в чашку Петрі з агарізоване середовище и поміщається під біолістічну гармату на відстані 10-15 см. У гарматі вакуумний насос зменшується Тиск до 0,1 атм. У момент скидання тиску вольфрамові частинки з Величезне швідкістю викидають з біолістічної Гарматій І, розріваючі клітінні стінкі, входять в цитоплазму и ядро ??клітін.
Зазвічай клітіні, что розташовуються безпосередно по центру, гинут за велічезної кількості и тиску вольфрамових часток, тоді як в зоне 0,6-1 см від центру знаходяться найбільш вдалині протрансформіровані Клітини. Далі...
