ustify"> Специфічність ПЛР заснована на утворенні комплементарних комплексів між матрицею і праймерами, короткими синтетичними олігонуклеотидами довжиною 18-30 підстав. Кожен з праймерів комплементарний одному з ланцюгів двуцепочечной матриці і обмежує початок і кінець ампліфіціруемого ділянки. p align="justify"> Після гібридизації матриці з праймером (відпал [11]), останній служить затравкою для ДНК-полімерази при синтезі комплементарного ланцюжка матриці (див. нижче).
Найважливіша характеристика праймерів - температура плавлення (T m ) комплексу праймер-матриця. m - температура, при якій половина ДНК-матриць утворює комплекс з олігонуклеотидних праймером. Температуру плавлення можна приблизно визначити за формулою
,
де: nX - кількість нуклеотидів Х в праймері.
У разі невірного вибору довжини і нуклеотидного складу праймера або температури відпалу можливе утворення частково комплементарних комплексів з іншими ділянками матричної ДНК, що може призвести до появи неспецифічних продуктів. Верхня межа температури плавлення обмежений оптимумом температури дії полімерази, активність якої падає при температурах вище 80 В° C.
При виборі праймерів бажано дотримуватися наступних критеріїв:
В· GC-складу ~ 40-60%;
В· близькі T m праймерів (відмінності не більше, ніж на 5 В° C);
В· відсутність неспецифічних вторинних структур - шпильок [12] і димерів [13];
В· бажано, щоб на 5 -кінці був гуанін або цитозин, оскільки вони утворюють три водневі зв'язки з молекулою матриці , роблячи гібридизацію більш стабільною.
В
Рис. 1. ? Ампліфікатор для проведення ПЛР
ПЛР проводять у ампліфікаторі - приладі, що забезпечує періодичне охолоджування і нагрівання пробірок, зазвичай з точністю не менше 0,1 В° C. Сучасні ампліфікатори дозволяють задавати складні програми, в тому числі з можливістю В«гарячого стартуВ», ​​Touchdown ПЛР (див. нижче) і подальшого зберігання ампліфікованих молекул при 4 В° C. Для ПЛР в реальному часі випускають прилади, обладнані флуоресцентним детектором. Існують також прилади з автоматичною кришкою і відділенням для мікропланшет, що дозволяє вбудовувати їх в автоматизовані системи. <В
Фотографія гелю, що містить маркерну ДНК (1) і продукти ПЛР-реакції (2, 3). Цифрами показана довжина фрагментів ДНК в парах нуклеотидів
Зазвичай при проведенні ПЛР виконується 20-35 циклів, кожен з яких складається з трьох стадій (рис. 2).
Двухцепочечную ДНК-матрицю нагрівають до 94-96 В° C (або до 98 В° C, якщо використовується особливо термостабільна полімераза) на 0,5-2 хв., щоб ланцюга ДНК розійшлися. Ця стадія називається денатурацією , так як руйнуються водневі зв'язки між двома ланцюгами ДНК. Іноді перед першим циклом (до додавання полімерази) проводять попереднє прогрівання реакційної суміші протягом 2-5 хв. для повної денатурації матриці і праймерів. Такий прийом називається гарячим стартом , він дозволяє знизити кількість неспецифічних продуктів реакції.
Коли ланцюга розійшлися, температуру знижують, щоб праймери могли зв'язатися з одноцепочечной матрицею. Ця стадія називається відпалом . Температура відпалу залежить від складу праймерів і зазвичай вибирається на 4-5 В° С нижче їх температури плавлення. Час стадії - 0,5-2 хв. Неправильний вибір температури відпалу приводить або до поганого зв'язування праймерів з матрицею (при завищеною температурі), або до зв'язування в невірному місці і появі неспецифічних продуктів (при заниженій температурі).
ДНК-полімераза реплицирует <# "justify"> В· В«ВкладенаВ» ПЛР (Nested PCR (англ.)) - застосовується для зменшення числа побічних продуктів реакції. Використовують дві пари праймерів і проводять дві послідовні реакції. Друга пара праймерів амплифицируют ділянка ДНК всередині продукту першої реакції.
В· В«ІнвертованаВ» ПЛР (Inverse PCR (англ.)) - використовується в тому випадку, якщо відомий лише невелика ділянка усередині потрібної послідовності. Цей метод особливо корисний, коли потрібно визначити сусідні послідовності після вставки ДНК в геном. Для здійснення інвертованою ПЛР проводять ряд розрізання ДНК рестріктазами з подальшим з'єднанням фрагм...
