люоресцирующими антитілами в рідині. При цьому клітини можуть бути оброблені різними антитілами, поміченими різними флюорохромами. Пропускаючи такі суспензії через спеціальний проточний флюоріметре, можна одночасно виявити і підрахувати різні види клітин. Приєднавши до проточного флюоріметре прилад, іменований сортером, можна виділити або видалити з суспензії ті клітини, які необхідні досліднику або лікаря. p align="justify"> Сучасні імунофлюоресцентні, імуноферментальні та радіоімунного методи відрізняються високою чутливістю (виявлення 0,0005-0,00005 мкг/мл білка), специфічністю, відтворюваністю, можливістю виявлення широкого кола біологічних речовин. Сучасні виробничі фірми готують всі необхідні інгредієнти та обладнання для їх використання. p align="justify"> Таким чином, розвиток серологічних методів діагностики відбувається в даний час в наступному напрямку:
В· використання мічених антигенів або антитіл за допомогою флюорохромами, ферменту або радіоактивної мітки;
В· постановка реакції на твердофазній носії - полістероловой планшеті з лунками з нанесеними в них антигенами або антитілами.
Це дозволяє підвищити чутливість методу, автоматизувати постановку реакції і використовувати спеціальну апаратуру для зняття результатів.
4. ПЛР-діагностика
кров серологічний антиген фагоцит
Метод заснований на багаторазовому виборчому копіюванні певної ділянки ДНК за допомогою ферментів в штучних умовах ( in vitro ). При цьому відбувається копіювання тільки тієї ділянки, яка задовольняє заданим умовам, і тільки в тому випадку, якщо він присутній в досліджуваному зразку. На відміну від ампліфікації ДНК в живих організмах, (реплікації), за допомогою ПЛР амплифицируют відносно короткі ділянки ДНК. У звичайному ПЛР-процесі довжина копійованих ДНК-ділянок становить не більше 3000 пар основ (3 kbp [8]). За допомогою суміші різних полімераз, з використанням добавок і за певних умов довжина ПЛР-фрагмента може досягати 20-40 тисяч пар нуклеотидів. Це все одно значно менше довжини хромосомної ДНК еукаріотичної клітини. Наприклад, геном людини складається приблизно з 3 млрд. пар основ.
Для проведення ПЛР у найпростішому випадку потрібні наступні компоненти:
В· ДНК-матриця , що містить ту ділянку ДНК, який потрібно ампліфікувати .
В· Два праймера , комплементарні протилежних кінцях різних ланцюгів необхідного фрагмента ДНК.
В· Термостабільна ДНК-полімераза - фермент , який каталізує реакцію полімеризації ДНК. Полімераза для використання в ПЛР повинна зберігати активність при високій температурі тривалий час, тому використовують ферменти, виділені з термофілів - Thermus aquaticus (Taq -полімераза), Pyrococcus furiosus (Pfu-полімераза), Pyrococcus woesei (Pwo-полімераза) та інші.
В· дезоксирибонуклеозидтрифосфатов (dATP, dGTP, dCTP, dTTP).
В· Іони Mg 2 + , необхідні для роботи полімерази .
В· Буферний розчин , що забезпечує необхідні умови реакції - рН , іонну силу розчину . Містить солі, бичачий сироватковий альбумін .
Щоб уникнути випаровування реакційної суміші, в пробірку додають висококиплячих масло, наприклад, вазелінове. Якщо використовується ампліфікатор з підігріває кришкою, цього робити не потрібно. p align="justify"> Додавання пірофосфатази може збільшити вихід ПЛР-реакції. Цей фермент каталізує гідроліз пірофосфату , побічного продукту приєднання нуклеозидтрифосфатів до зростаючої ланцюга ДНК, до ортофосфата . Пірофосфат може інгібувати ПЛР-реакцію [10].
