ванні певної ділянки ДНК за допомогою ферментів в штучних умовах ( in vitro ). При цьому відбувається копіювання тільки тієї ділянки, яка задовольняє заданим умовам, і тільки в тому випадку, якщо він присутній в досліджуваному зразку. На відміну від ампліфікації ДНК в живих організмах, (реплікації), за допомогою ПЛР амплифицируют відносно короткі ділянки ДНК.
Для проведення ПЛР у найпростішому випадку потрібні наступні компоненти:
· ДНК-матриця, що містить ту ділянку ДНК, який потрібно ампліфікувати.
· Два праймера, комплементарні протилежних кінцях різних ланцюгів необхідного фрагмента ДНК.
· Термостабільна ДНК-полімераза - фермент, який каталізує реакцію полімеризації ДНК. Полімераза для використання в ПЛР повинна зберігати активність при високій температурі тривалий час, тому використовують ферменти, виділені з термофілів - Thermusaquaticus (Taq-полімераза), Pyrococcusfuriosus (Pfu-полімераза), Pyrococcuswoesei (Pwo-полімераза) та інші.
· дезоксирибонуклеозидтрифосфатов (dATP, dGTP, dCTP, dTTP).
· Іони Mg2 +, необхідні для роботи полімерази.
· Буферний розчин, що забезпечує необхідні умови реакції - рН, іонну силу розчину.
2. Виділення ПЛР-продукту з гелю
Електрофорез ДНК - це аналітичний метод, застосовуваний для розділення фрагментів ДНК за розміром (довжині) і формі (у разі, якщо ДНК утворює вторинні структури, наприклад шпильки). Сили електричного поля, що прикладається до зразків, змушують фрагменти ДНК мігрувати через гель. Сахарофосфатний остов молекул ДНК заряджений негативно і тому ланцюга ДНК рухаються від катода, зарядженого негативно, до позитивного анода. Більш довгі молекули мігрують повільніше, так як затримуються в гелі, більш короткі молекули рухаються швидше.
До зразків зазвичай додають низькомолекулярний кислий барвник (наприклад, динитрофенол, бромфеноловий синій), щоб візуалізувати хід електрофорезу в процесі. Барвник також необхідний для того, щоб визначити, коли варто зупинити процес.
Після поділу (іноді барвник вносять у розплавлену агарозу) фрагменти ДНК різної довжини візуалізують за допомогою флюоресцентних барвників, специфічно взаємодіють з ДНК, наприклад, агарозном гелі зазвичай фарбують бромистим етидієм, який інтеркалірует між азотистими підставами дуплексу і флюоресцирует в УФ-променях.
Визначення розмірів виробляють шляхом порівняння комерційно доступних фрагментів ДНК (DNA ladder, «лінійка»), що містить лінійні фрагменти ДНК відомої довжини.
Виділення продуктів з гелю здійснюється, спочатку механічним виділенням необхідної ділянки агарозного гелю, в якому поміщена ДНК, а потім за допомогою спеціальних наборів («ЄВРОГЕН», «Glassmilk», і т.д.) проводиться екстракція ДНК.
3. Лигирование амплікона в вектор (зазвичай плазмида) - утворення фосфодіефірних зв'язку між двома підставами одного ланцюга ДНК, розділених розривом , за допомогою ферменту ДНК-лігази. ДНК-лігази абсолютно необхідні в процесах ре...
