фрагментів цих плазмід.
Для конструювання рекомбінантної ДНК, що містить у своєму складі ген, який повинен експресуватися, дотримуються наступної стратегії. Синтезують до ДНК або з клонотекі виділяють клітини, що несуть фрагмент генома з потрібним геном, і клонують їх у відповідному векторі. Фрагменти геномної ДНК піддають модифікації - видаляють з них некодуючі області та ділянки сусідніх генів. Часто для проведення цієї операції необхідно секвенування даного фрагмента ДНК. Потім конструюються проміжні рекомбінантні ДНК, в яких ген міститься під контроль бактеріальних регуляторних елементів (промотор, оператор, точка зв'язування з рибосомами). Ці регуляторні елементи виділяють з гібридних плазмід, сконструйованих спеціально як джерела регуляторних елементів. Отримана конструкція вбудовується в підходящий вектор, наприклад, pBR 322, і ген експресується в бактеріальної клітці.
Однак зручніше вбудовувати ген в спеціальний вектор для експресії, який вже містить регуляторні елементи, що забезпечують активну експресію після введення рекомбінантної плазміди в бактеріальну клітину. До таких ефективним регуляторним ділянкам відноситься, наприклад, сильний промотор гена бета-лактамази (ген стійкості до пеніциліну, що входить до складу плазміди pBR 322). Ряд генів, в тому числі і ген інсуліну, вбудовували в сайт рестрикції Pst I, який розташований у структурній частині гена. Промотор цього гена забезпечує ефективну транскрипцію, яка продовжується до тих пір, поки РНК-полімераза не дійде до сигналу термінації вбудованого гена.
Як приклад маркування вектора можуть служить перші експерименти з E. coli, а точніше з однією з її плазмід рBR322, проведені Гилбертом для отримання інсуліну. Плазміда pBR322 містить 2 гена, які визначають стійкість до ампіциліну і тетрацикліну. Рестріктаза PstI розщеплює плазміду в середній частині гена, що кодує фермент стійкості до ампіциліну. Після розщеплення плазміди на її кінці за допомогою кінцевий трансферази надбудовували послідовність з чотирьох нуклеотидів із залишками гуаніну. Потім, як звичайно, за допомогою лигаз «вшивали» ген проінсуліна, отримуючи рекомбінантний ДНК. Вбудований в плазміду фрагмент ДНК порушував синтез ферменту, що руйнує ампіцилін, але ген, що забезпечує стійкість до тетрацикліну, залишався активним. Трансформовані таким чином клітини E. coli синтезували гібридний білок, що містить послідовності пеніціллази і проінсуліна, тому біологічно активний інсулін отримували шляхом відщеплення пеніціллази та середнього сегмента проінсуліна.
З іншого боку, якщо фрагмент чужорідної ДНК вбудовується в один з генів стійкості, то останній інактивується. Отже, успішне вбудовування фрагмента чужорідної ДНК в один з цих генів легко детектувати по зникненню у бактерій стійкості до даного антибіотика.
4. Основні етапи трансформації E. Coli
молекулярне клонування кишкова паличка
1. Ампліфікація цікавить ділянки гена за допомогою полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР) - експериментальний метод молекулярної біології, що дозволяє домогтися значного збільшення малих концентрацій певних фрагментів нуклеїнової кислоти (ДНК) в біологічному матеріалі (пробі).
Метод заснований на багаторазовому виборчому копію...
