парації ДНК і в процесах реплікації - при подвоєнні ланцюга ДНК. Лигирование застосовують в молекулярній біології для з'єднання будь-яких молекул ДНК.
Спочатку проводиться рестрикция зразка ДНК і плазміди однієї і тієї ж рестриктазою (по липким або тупим кінців), потім за допомогою водневих зв'язків липкі кінці плазміди і зразка ДНК «зачиняються» але залишається розрив на векторі, оскільки нуклеотиди самі не здатні утворювати фосфодіефірні зв'язку. Для цього додається фермент ДНК-лізага, яка утворює фосфодіефірні зв'язку в новій гібридної молекулі ДНК. Тепер ми маємо готовий вектор.
4. Трансформація отриманим вектором E. Coli
Трансформація - то перенесення вектора в клітини спеціального штаму E. coli
Трансформація складається з двох частин це отримання компетентних клітин з нічного висіву бактерій з суспензійну середовище і безпосередньо трансформація. Між цими двома етапами часто використовують нетривалого заморозку в рідкому азоті або холодильнику на - 80, що покращує продуктивність. Отримання компетентних клітин проходить у кілька етапів, суть яких полягає спочатку у відділенні клітин від середовища LB, а потім у приміщенні в розчин хлориду кальцію з 10мм TrisHcl і 60% розчин гліцерину. На всіх етапах використовують центрифугування на низьких оборотах (4600об/мін). Безпосередньо трансформація здійснюється дією на клітини теплового шоку, після додавання розчину плазміди, суміш охолоджують до +4 градусів, а потім на 2 хвилини поміщають на водяну баню на +42 градуси. У цей час клітина «захоплює» плазміди, і після додавання середовища LB отриману суміш інкубують в термостаті близько години на +37 градусів. Після цього відбувається розтирання клітин на тверду середу, в яку заздалегідь був доданий антибіотик.
5. Відбір клонів (бактерії, що містять вставку в плазміді шуканої послідовності)
Відбір клонів здійснюється реакцією ПЛР на досліджувані вставки. Детекція ампліфікованого ПЛР-продукту здійснюється так само за допомогою електрофорезу. За наявності необхідної вставки, ПЛР продукти використовуються надалі при реакції секвенування.
6. Секвенирование - визначення послідовності ДНК досліджуваного ПЛР-продукту.
5. Практичне застосування трансформованих мікроорганізмів
Важливою складовою частиною біотехнології є генетична інженерія. Народившись на початку 70-х років, вона домоглася сьогодні великих успіхів. Методи генної інженерії перетворять клітини бактерій, дріжджів і ссавців у «фабрики» для масштабного виробництва будь-якого білка. Це дає можливість детально аналізувати структуру і функції білків і використовувати їх в якості лікарських засобів.
Нині кишкова паличка ( E. coli ) стала постачальником таких важливих гормонів як інсулін і соматотропин . Раніше інсулін отримували з клітин підшлункової залози тварин, тому вартість його була дуже висока. Для отримання 100 г кристалічного інсуліну потрібно 800-1000 кг підшлункової залози, а одна заліза корови важить 200 - 250 грам. Це робило інсулін дорогим і важкодо...
