суд обробляють в 2% -му розчині гідроокису натрію 5-6 годин, обполіскують 3-4 рази проточною водою, замочують на ніч в миючий розчин, ретельно миють, промивають
- 10 разів проточною водою, витримують 1-2 години в розчині соляної кислоти, промивають 4-5 разів проточною водою і обполіскують 5-6 разів дистильованою водою.
Гумові вироби (пробки, груші) спочатку кип'ятять 1:00, а потім обполіскують 3 рази дистильованою водою, висушують, загортають у пергаментний папір і стерилізують в автоклаві.
Металеві інструменти миють гарячою водою з милом, промивають проточною і дистильованою водою, стерилізують кип'ятінням у дистильованій воді протягом 30 хвилин. Під час роботи інструменти знаходяться в посуді з 96 0 - им етиловим спиртом, перед використанням їх прожарюють.
3. Методика отримання первинно-трипсінізірована культури клітин з шкірно-м'язової тканини розвиваються курячих ембріонів
курячі ембріони (отримані з господарства благополучного з інфекційних захворювань птахів) 11-денної інкубації овоскопіровалі. Відбирали яйця з рухомими ембріонами і добре вираженими судинами. На шкаралупі простим олівцем відзначали кордону повітряної камери і розташування зародка.
Поверхность шкаралупи протирали йодованим спиртом.
Стерильними ножицями зрізали шкаралупу на 2 - 3 мм вище межі повітряної камери, розірвали подскорлупную і хоріоалантоісную оболонки і за шийку витягли ембріон в стерильну чашку Петрі. У ембріона видалили головку, лапки, крила і внутрішні органи. Залишившись шкірно-м'язовий мішок перенесли в іншу стерильну чашку Петрі і подрібнили ножицями на шматочки 3-4 мм.
Подрібнену тканину 2-3 рази відмили розчином Хенкса від слизу і кров'яних елементів до отримання прозорих зливних вод і перенесли в колбу для тріпсінізаціі. У колбу налили 0,25% розчин трипсину, підігрітого до 37 0 С (співвідношення тканини і трипсину 1: 3), внесли стерильний магніт і поставили на магнітну мішалку. Тріпсінізаціі проводили дробно кілька разів по 5 хвилин. Трипсин з клітинами, які відокремилися, зливали через 3 шари марлі в колбу, яку поміщали в холодильник для припинення дії ферменту. Тріпсінізаціі проводили 5 разів до повного виснаження тканини.
Суспензію клітин розлили в центрифужні пробірки і центрифугували 10 хвилин при 1000 об/хв.
Надосадову рідину злили, до осаду клітин додали невелику кількість ростової середовища.
Кількість клітин вважали в камері Горяєва.
Кількість клітин в 1 мл суспензії визначали за формулою:
Х=(А Ч 9 Ч 1000): 0,9, де
А - середня кількість клітин в одній камері;
, 9 - об'єм камери Горяєва в мм 3;
- кількість мм 3 в 1 см 3;
- коефіцієнт розведення суспензії.
Після цього суспензію клітин розвели ростової середовищем до оптимальної концентрації. Для знищення бактеріальної мікрофлори до середовища додали антибіотики: 1000 ОД пеніциліну і 1000 мкг стрептоміцину. Перелили в пробірку, додали Геоссен (1 мл) і закрили пробкою. На пробірці восковим олівцем провели подовжнюлінію, вказали число, поклали в лоток поздовжньої лінією вгору під кутом 5 0 і помістили в термостат при температурі 37 0 С.
Результати власних досліджень: спостереження за ростом моношару проводили через 24-48 годин. Через 24 години культивування моношару клітини частково прикріпилися до скла. Через 48 годин спостерігали рівномірний ост моношару. У процесі культивування колір живильного середовища не змінився.
Висновки
1. Швидкий розвиток методу клітинних культур та їх широке застосування у практичній вірусології пов'язано з тим, що культура клітин є найбільш досконалою лабораторної системою для культивування вірусів.
2. Приготування первинно-трипсінізірована культури клітин є дуже важливим, тому що з неї отримують інші культури клітин.
. Робота з культурою клітин вимагає абсолютної стерильності, ретельної підготовки посуду, відповідних розчинів, поживних середовищ і високої якості води.
Список використаної літератури
1.Анджапарідзе О.Г. Використання культури тканин в вірусологічних дослідженнях.- М., 1964
2.Маленков А.Г. Біофізика.- М., 1963
.Нортроп Д. Кристалічні ферменти.- М., 1950
.Панікар І.І. Практикум з ветеринарної вірусології.- Харків, 1990
.Сергеев В.А. Розмноження вірусів тварин в культурі тканини.- М .: Колос, 1966
.Сергеев В.А. Репродукція та виро...
