"> Всі проби центрифугують 15 хв при 3000 об/мін. Зливають надосадову рідину (її обсяг 2 мл) в три інші пробірки, додають по 1 мл розчину тіобарбітурової кислоти і поміщають проби на 10 хв у киплячу водяну баню. Потім пробірки охолоджують у крижаній воді. p align="justify"> Вимірюють екстинкцію отриманих проб проти контролю на спектрофотометрі при 532 нм або на ФЕК (світлофільтр зелений) в кюветі з товщиною шару 1 см.
Розрахунок за формулами
Е13? 6 Е23? 6
х1 = ---- і х2 = ----,
0,156 0,156
де х1 - швидкість утворення в пробі малонового діальдегіду в присутності прооксидантів (індуковане пероксидне окислення ліпідів), нмоль? год-1;
х2 - швидкість утворення в пробі малонового діальдегіду в відсутність прооксидантів (спонтанне пероксидне окислення ліпідів), нмоль? год-1;
- обсяг проби, мл;
- коефіцієнт перерахунку на 1 годину;
, 156 - екстинкція 1 нмоль при 532 нм;
Е1 і Е2-екстинкції відповідно першої та другої проб проти контролю.
б. Визначення швидкості пероксидного окислення ліпідів у гомогенатах тканин. Принцип методу описаний вище. p align="justify"> Хід визначення. Наважку 0,5 г печінки гомогенізують в 19,5 мл охолодженого до 0-4? З розчину хлориду калію, помістивши склянку гомогенізатора в лід або сніг. Отриманий гомогенат зливають в пробірку. p align="justify"> В одну пробірку наливають 2,0 мл гомогенату і 0,2 мл дистильованої води, в другу - 2 мл гомогенату і по 0,1 мл розчинів аскорбінової кислоти і солі Мора, в третю - ті ж речовини , що і в другу, і, крім того, додають 1 мл розчину трихлороцтової кислоти.
Всі пробірки поміщають на 10 хв у водяну баню при 37 Вє С, після чого додають у перші дві пробірки по 1 мл розчину трихлороцтової кислоти. Далі все проби центрифугують 10 хв при 3000 об/хв. p align="justify"> По 2 мл надосадової рідини відбирають в три чисті пробірки, доливають по 1 мл розчину тіобарбітурової кислоти і поміщають проби в киплячу водяну баню на 10 мин. Після цього їх охолоджують у крижаній воді до кімнатної температури. p align="justify"> Вимірюють екстинкцію всіх проб проти контрольного розчину (2 мл розчину хлориду калію, 1 мл розчину трихлороцтової кислоти і 1 мл розчину тіобарбітурової кислоти, витримують 10 хв на киплячій водяній бані і охолоджують у крижаній воді до кімнатної температури) на спектрофотометрі при 532 нм або ФЕК (світлофільтр зелений) в кюветі з товщиною шару 1 см.
Розрахунок проводять за формулами:
Е1 (Е2) 3? 3,2? 6 Е33? 3,2
х1 (х2) = ------ і х3 = ------,
0,156? 2 0,156? 2
де х1 - швидкість спонтанного пероксидного окислення ліпідів у гомогенатах, вимірюється в наномолях утворився малонового діальдегіду в пробі за годину інкубації;
х2 - швидкість аскорбат-залежного неферментативного пероксидного окислення ліпідів у наномолях утворився малонового діальдегіду в пробі за годину інкубації;
х3 - вміст малонового діальдегіду у вихідному гомогенаті, нмоль;
Е1, Е2 і Е3-екстинкції відповідно першої, другої і третьої проб;
, 2 - загальний обсяг досліджуваних проб, мл;
- обсяг надосадової ждкості, взятої на визначення малонового діальдегіду, мл;
- обсяг проб, взятих на фотометрію, мл;
, 156 - екстинкція 1 нмоль малонового діальдегіду в 1 мл при 532 нм;
Оформлення роботи. Розрахувати отримані результати, дати порівняльну характеристику швидкості спонтанного та індукованого пероксидного окислення ліпідів, зробити висновок про можливість використання методу для оцінки швидкості пероксидного окислення ліпідів і його застосовності на практиці. p align="justify"> Практичне значення роботи. Методи визначення швидкості пероксидного окислення ліпідів біомембран важливі для оцінки дії на цю систему природних речовин і ксенобіотиків, серед яких можуть бути як прооксіданти, так і антиоксиданти. Ці дослідження дають можливість практично використовувати виявлений ефект різних сполук, в тому числі лікарських засобів. p align="justify"> Збільшення швидкості пероксидного окислення ліпідів можливо при старінні, гіповітамінозі Е, дефіциті селену, дії іонізуючого опромінення, гіпербаричної оксигенації (дії кисню під підвищеним тиском), при деяких захворюваннях і патологічних станах (серцево-судинних захворюваннях, гіпоксії , отруєнні чотирьоххлористим вуглецем, гіпервітамінозах А і D і т.д.).
Гемоглобін і кисень, що містяться в еритроцитах, прискорюють пероксидне окислення ліпідів, що викликає пошкодження мембран еритроцитів...
