зчину. p align="justify"> Осад еритроцитів у центрифужних пробірках знову приготування суспензії, втягуючи і видуваючи рідина піпеткою, і залишають їх стояти при 20-22? З ще на 30 хв. Після закінчення цього часу проби знову центрифугують в тому ж режимі, відбирають по 0,1 мл надосадової рідини в три чисті пробірки і доливають у них по 5 мл аміачного розчину. p align="justify"> Після додавання аміачного розчину всі шість пробірок закривають шматочком фольги і енергійно струшують вміст 2 хв. Потім вимірюють екстинкцію в пробах проти контролю на ФЕК або на спектрофотометрі при 540 нм (світлофільтр зелений) в кюветі з товщиною шару 1 см.
Розрахунок проводять за формулою
Е3100 Е2100
х = ---- і А = -----,
Е1 Е1
де х - ступінь гемолізу при додаванні ергокальциферолу,%;
Е1 - екстинкція проби з ергокальціферолом;
Е3 - екстинкція контрольної проби;
А - ступінь гемолізу після спільного додавання ергокальциферолу і ? - токоферолу,%
Е2 - екстинкція проби з ергокальціферолом і ? - токоферолом.
Гальмування антиоксидантом пероксидного окислення (у%) розраховують за формулою
А100
-----.
х
Оформлення роботи. Провести необхідні розрахунки і зробити висновок про причини спонтанного гемолізу, а також про дію досліджуваних прооксидантів і антиоксидантів. p align="justify"> Практичне значення роботи. За ступенем гемолізу еритроцитів можна судити про стан антиокисних систем клітини, зокрема, про забезпеченість організму вітаміном Е. При нормальній забезпеченості спонтанний гемоліз, як правило, становить 2-10%. Нестача вітаміну Е різко підвищує цей показник. Мається відповідність між спонтанним або індукованим гемолізом і змістом токоферолів у сироватці крові. Здатність вітаміну D2 прискорювати пероксидне окислення ліпідів у мембранах еритроцитів і інших клітин свідчить про його прооксидантних властивостях. br/>
Робота 108. Визначення швидкості пероксидного окислення ліпідів у біомембранах
Реактиви. Тріс-HCl буфер, 0,04 М розчин з рН 7,4 *; сіль Мора - Fe (NH4) 2 (SO4) 2, 4.10 -5 М свіжоприготований розчин; трихлороцтової кислота, 40%-ний розчин; тіобарбітуровую кислота , 0,8%-ний свіжоприготований розчин; оксалат натрію, 1,34%-ний розчин; хлорид натрію, 0,9%-ний розчин; хлорид калію, 1,2%-ний розчин.
Обладнання. Штатив із пробірками; піпетки місткістю 0,1; 1 і 5 мл; пастерівські піпетки; гумова груша; водяна баня з термометром або водяна баня апарату Варбурга; аптечні ваги з важками; спектрофотометр або ФЕК типу КФК-2. p align="justify"> Матеріал.
Кров, взята у суміші з розчином оксалату натрію в співвідношенні 10:1 (за об'ємом).
Печінка свежезабітого тварини.
а. Визначення швидкості пероксидного окислення ліпідів в мембранах еритроцитів. Метод заснований на визначенні змісту кінцевого продукту пероксидного окислення ліпідів - малонового діальдегіду, який при взаємодії з тіобарбітурової кислотою утворює забарвлений в рожевий колір тріметіновий комплекс, що має максимум поглинання при 530-532 нм:
В
Забарвлення розчину пропорційна концентрації малонового діальдегіду. Молярний коефіцієнт екстинкції 1,56 • 10-5л В· моль-1 В· см-1. p> Хід визначення. Оксалатного кров центрифугують 10 хв при 3000 об/хв, облягаючи еритроцити. Верхній шар відсмоктують, а осад еритроцитів тричі промивають розчином хлориду натрію і переосаждают при тому ж режимі центрифугування. p> Відбирають 0,5 мл осаду еритроцитів в чисту центрифужну пробірку, доливають рівний об'єм дистильованої води і залишають стояти 30 хв для повного гемолізу.
Пробу центрифугують 30 хв при 3000 об/хв, обережно відсмоктують пастерівської піпеткою супернатант з сіркою прошарком мембран еритроцитів і переносять в іншу пробірку.
Беруть три чисті пробірки. У першу дослідну вносять по 0,3 мл розчинів солі Мора, трис-буфера, аскорбінової кислоти і 0,1 мл отриманої суспензії мембран еритроцитів. В другу дослідну доливають 0,3 мл трис-буфера, 0,1 мл суспензії мембран еритроцитів і 0,6 мл дистильованої води. У третю (контроль) додають ті ж реактиви, що і в першу пробірку, після чого відразу підливають 1 мл розчину трихлороцтової кислоти. p> Всі пробірки поміщають у водяну баню (або в баню апарату Варбурга) і інкубують проби 20 хв при 37? С. Реакцію в дослідних пробах зупиняють, додаючи в обидві пробірки по 1 мл розчину трихлороцтової кислоти. p align="justify...
