Рекомбінантні противірусні вакцини
1. Отримання відповідного фрагмента нуклеїнової кислоти
Для конструювання рекомбінантних РНК або ДНК необхідно отримати фрагмент
нуклеїнової кислоти, який в подальшому і буде вбудовуватися в векторну молекулу.
Фрагменти ДНК для вбудовування в вектор можна отримати безпосередньо з хромосомної ДНК, розщепивши її рестріктазами або зруйнувавши випадковим чином (наприклад, за допомогою ультразвуку) на сегменти з приблизно однаковою довжиною. Виділення генів за допомогою В«вирізанняВ» з генома, як правило, складається з чотирьох етапів: 1) отримання клонотекі фрагментів геному; 2) виявлення фрагментів геному, що містять необхідний ген, і точна локалізація гена в даному фрагменті; 3) вирізання гена з фрагмента ( ів) за допомогою рестриктаз і зшивання ділянок гена за допомогою ДНК-лігази фага Т4, якщо ці ділянки отримані з різних фрагментів; 4) ампліфікація гена у складі векторної молекули. Зазначений спосіб отримання генів є найбільш прийнятним стосовно до протозойних збудників, бактеріям і для деяких складно влаштованих ДНК-вірусів. Такі операції проводяться, зокрема, при створенні так званих В«бібліотек генівВ», тобто набору однакових векторних систем, у сукупності що несуть в собі весь геном даного організму. Однак цей підхід має ряд істотних недоліків. По-перше, дуже складна задача підбору рестріктаз, що дозволяють вирізати з геномної ДНК або клонованої фрагмента геному цілісний ген. Як правило, разом з геном залишаються фланкирующие його зайві нуклеотидні послідовності, що заважає подальшому використанню цього гена, або ж рестриктази відрізають частину гена, роблячи його функціонально неповноцінним. По-друге, створення клонотекі геному збудника представляє спеціальну задачу і вимагає великих витрат часу. Нарешті, для ряду ДНК-вірусів (паповавіруси) доведений сплайсірованний характер структури генів. Цілком зрозуміло, що виділені гени цих вірусів внаслідок наявності інтронних областей не будуть проявляти функціональної активності в бактеріальних клітинах і виявляться непридатними при вирішенні завдань з конструювання рекомбінантних противірусних вакцин. По-третє, якщо ген складає незначну частку від усієї геномної ДНК, то виникають великі труднощі з його ізоляцією і ідентифікацією. p align="justify"> Найбільш поширеним є шлях отримання генів через синтез ДНК-копій (кДНК) інформаційних або будь-яких інших (в оптимальному випадку - індивідуальних) РНК шляхом їх зворотної транскрипції. Даний спосіб включає в себе три етапи: 1) виділення високоочищених мРНК, що кодують структурні білки, або виділення геномних РНК вірусів; 2) синтез двухцепочечной ДНК (гена) на матрицях РНК; 3) ампліфікація гена за допомогою методів молекулярного клонування.
Як зазначалося, першим етапом...
