Санкт-Петербурзький Державний Університет,
Біолого-грунтовий факультет, кафедра біохімії, 2012.
Доповідь для семінару з біохімії ліпідів
На тему: Методи аналізу гликолипидов (цереброзидів і сульфатиди). Особливості виділення і визначення.
1. Актуальність теми
Гліколіпіди - це складні ліпіди, що містять вуглеводні залишки. Основою більшості гліколіпідів є сфингозин - вищий ненасичений алифатический аміноспирт з двома гідроксильними групами.
Основним вуглеводом є галактоза, але також можлива присутність глюкози та ін., Гліколіпіди можуть бути нейтральними: моногексозілцераміди (цереброзидів) і олігогексозілцераміди. Серед кислих гликолипидов виділяють: гангліозиди, що містять вуглевод N-ацетілнейраміновой кислоту, і сульфатиди, несучі сульфатну групу.
Мова піде про гліколіпідом тваринного походження.
Великі дослідження шкірних ліпідів показали, що ліпіди рогового шару багаті гліколіпідами і Сфинголипидами. Структура гликолипидов піддається значним змінам у ході клітинного росту, диференціювання клітини, і зокрема, при переході клітини з нормального стану в пухлинне. У зв'язку з чим виявляється великий інтерес до ролі і діагностичної значимості гликолипидов в різних захворюваннях.
цереброзидів і сульфатиди є найважливішими компонентами мієліну, які виконують як структурну, так і функціональну роль. У головному мозку новонароджених ці гліколіпіди присутні в незначній кількості, і накопичення їх відбувається в постембріональний період в ході мієлінізації. Метаболізм гликолипидов в ранній період формування нервової системи ще мало вивчений. Дослідження цереброзидів і сульфатідов представляє особливий інтерес у зв'язку з тим, що порушення в їх метаболізмі призводять до серйозних наслідків - до розвитку демієлінізуючих захворювань (розсіяний склероз, фенілкетонурія, енцефаломієліти та ін.). Поглиблене вивчення даних гликолипидов, як при зміні функціонального стану організму, так і при моделюванні демієлінізуючих захворювань на тваринах дозволить наблизитися до з'ясування функціональної ролі цереброзидів і сульфатідов.
Говорячи про ганглиозидов, треба сказати, що вони локалізовані в нейрональних мембранах: соматичних, аксональних, дендритних, синаптичних - в самих збудливих елементах, які беруть безпосередню участь у передачі нервового імпульсу. Гангліозид є сполуками винятковою функціональної значимості: безсумнівна їх роль в транспорті іонів через мембрани, в рецепції нейромедіаторів, вірусів, токсинів, і, можливо, гормонів. Будучи обов'язковими компонентами екстраклеточной матриксу, гангліозиди багато в чому визначають клітинні контакти і міжклітинні взаємодії. Доведено, що при зміні числа і структури поверхневих ганглиозидов відбувається порушення міжнейрональні пізнавання. Питання про роль індивідуальних ганглиозидов в функціональної активності мозку ще далекий від вирішення, тому приділяється велика увага методам їх вивчення.
2. Виділення цереброзидів і сульфатідов головного мозку
Виділення гликолипидов складається з трьох основних етапів: отримання загальних ліпідів з тканини за методом Фолча, витяг ганглиозидов із загального ліпідного екстракту і власне виділення цереброзидів і сульфатідов за методом Азмена.
Метод Фолча:
Принцип методу: загальні ліпіди екстрагують з тканин сумішшю хлороформу і метанолу, екстракт відмивають від неліпідних домішок водою або слабкими сольовими розчинами і висушують.
Хід виділення:
Беруть різні навішування тканини, для мозку, як правило, досить 200-250мг.
Тканина промивають фізіологічним розчином, висушують на фільтрувальному папері, видаляють з неї великі кровоносні судини.
Тканина заливають сумішшю хлороформ - метанол (2: 1) і гомогенізують.
Гомогенат розбавляють сумішшю хлороформ - метанол (2: 1) до отримання розведення тканини 1:20. Щоб уникнути окислення ліпідів у проби додають антиоксидант. Гомогенат перемішують і фільтрують через знежирений фільтр.
Потім проводять промивку екстракту від неліпідних домішок (цукрів, амінокислот, солей), видобутих з тканин спиртовим компонентом хлороформних-метаноловой суміші. Промивку можна здійснювати дистильованою водою, при цьому об'єм води повинен становити 20% від обсягу екстракту ліпідів. У цьому випадку не утворюється проміжного шару між хлороформно і водно-метаноловой фазами, що дозволяє повністю видалити верхню фазу. Од...
