ти можна використовувати похідні pILnew, в pJIM2279 була здійснена вставка lux генів і була виміряна люціферазная активність при низькому і при високому числі копій вектора. При цьому спочатку вимірювалася активність експресії з промоторів розташованих у pJIM2279 проксимальніше MCS (Промотор кластера orfD-repE і промотор гена резольвази), а потім з промоторів клонованих в pJIM2366 і pJIM2367 (див. вище). Дані показали, що спостерігається чітка кореляція між дозою гена (Кількість копій вектора на клітину) і рівнем люціферазной активності. Був сконструйований клонуючий вектор pJIM2375, містить промотор mleS для конститувною експресії на середньому рівні в L . lactis , RBS і сайт для клонування Nde I. p> На основі pILnew були створені похідні векторів pJIM2278 і pJIM2279, в яких реплікон pILnew може бути відділений від маркера резистентності шляхом розрізу однієї рестриктазою в унікальному сайті рестрикції. На основі цього реплікону можна потім створювати нові вектори несучі різні маркери або гени-репортери.
pJIM2244 і pJIM2245 є похідними pJIM2279, що містять гени стійкості до еритроміцину і хлорамфеніколу відповідно. У цих конструкціях з усього полілінкера pJIM2279 залишений єдиний сайт Eco RI (у pJIM2245 також частина MCS плазміди pBluescript). pJIM2241 і pJIM 2246 є EmR і Cm R похідними pJIM2278 відповідно і містять велику частина полілінкера pJIM2278 на кінці BssH II фрагмента містить реплікон. Перші дві плазміди створені для відновлення реплікону pILnew без додаткових сайтів рестрикції. Інші дві плазміди дозволяють змінювати маркер, в той час як гени, клоновані в полілінкерамі, залишаються пов'язаними з репліконом.
1.5. Вектори для спрямованої інактивації генів
В
функції не охарактеризованих генів можна вивчити шляхом їх інактивації і подальшого спостереження ефекту інактивації при різних умовах зростання клітини. Для проведення инактива ції генів у B. subtilis створений набір векторів для здійснення інсерційного мутагенезу в хромосомі бактерії (Vagner et al., 1998). Дані вектори, позначені як pMUTIN, побудовані на основі реплікону ColE1 (рис.8), тому вони не здатні реплицироваться в кінцевому хазяїні ( B. subtilis ), що необхідно для проведення інсерційного мутагенезу. Вони містять ген-репортер lacZ для вимірювання активності промотора досліджуваного гена. Також у векторах присутній індуцібельний промотор P spac , необхідний для контролю експресії генів, що знаходяться в одному опероном з досліджуваним геном і розташованим дистальніше від нього. Даний промотор необхідний через можливе полярного ефекту вставки. Промотор P spac був модифікований для кращого контролю його активності. Він репресує репрессором LacI (кодується геном lacI , присутнім у векторі) і, отже, може бути індукований IPTG, інактивує...
