oriC - реплікаційний регіон pBluescript. br/>
Для того щоб за допомогою pILnew можна було здійснювати клонування, в нього був введений полілінкерамі в різній орієнтації з утворенням клонирующих векторів pJIM2278 і pJIM2279.
Сконструйований ряд векторів, що дозволяють виміряти активність промоторів за допомогою бактеріального люціферазного гена з Vibrio harvei в якості гена-репортера. Даний ген-репортер має ряд корисних властивостей: висока чутливість, можливість швидкого вимірювання активності, відсутність фонової активності в грампозитивних бактеріях. Були використані два варіанти генів люциферази. У першому випадку застосовувався кластер генів luxA і luxB ( luxA/ B ), у другому - продукт злиття генів ( luxAB ). Перевага системи luxA/ B над luxAB полягає в її високій термостійкості ( luxAB інактивується при температурі вище 37 В° C) і у відсутності токсичності в E. coli, що дозволяє створювати конструкції в цьому зручному проміжному господаря перед їх перенесенням в остаточного господаря. Однак ці гени можуть слабо транслюватися в деяких грампозитивних бактеріях, і використання злитих luxAB генів значно покращує чутливість системи в деяких господарях. p> Вектори pJIM2366 і pJIM2367 містять luxA/ B гени дистальніше полілінкера і двонаправлений термінатор his оперона Lactococcus lactis для запобігання транскрипції з проксимально розташованих промоторів. У даних векторах було успішно протестовано ряд промоторів з L. lactis при низькому і високому числі копій вектора (промотори оперонов mle , his і ald з L. lactis ). p> Активність багатьох генів регулюється на рівні трансляції. Тому була створена версія luxAB гена, що дозволяє вивчати ефективність сайтів зв'язування з рибосомою (RBS) для ініціації трансляції. Для цього на рівні инициаторного кодону гена luxAB був введений сайт Nde I, що дозволило здійснювати вставку RBS відразу перед стартовим кодоном цього гена. Транскрипція гена luxAB при цьому може ініціюватися з промоторів, розташованих проксимальніше. Вектор pJIM1715, містить злитий ген luxAB без RBS не виявляв люціферазную активність. У даний вектор була здійснена вставка різних фрагментів гена aldB L . lactis , RBS (Конструкція pJIM1723), RBS і анти-RBS (PJIM1728), а також RBS і промотор даного гена (pJIM1726). Дані, отримані за допомогою зазначених конструкцій, показали, що pJIM1715 можна успішно використовувати для вивчення трансляційної ефективності RBS.
Часто необхідно, щоб синтез продукту гена йшов на певному рівні. Для досягнення цього можна використовувати регульовані промотори різної сили. Зміна дози гена надає додатковий рівень контролю експресії гена. Щоб показати, що для цієї ме...
