, х.ч;
Фенілаланін, х.ч;
Тирозин, х.ч;
Цистеин, х.ч;
Аланін, х.ч;
Аргінін, х.ч;
аспаргіна, х.ч;
Глютамін, х.ч;
Гліцин, х.ч;
Пролин, х.ч;
Серін, х.ч;
2.2 Приготування розчинів
. 2.1 Приготування 1,0% розчину нингидрина
У мірну колбу місткістю 100,0 см3 поміщають 1,0 г нингидрина і доводять обсяг до мітки фосфатним буферним розчином pH 6,86. Розчин придатний протягом двох тижнів при зберіганні в холодильнику.
2.2.2 Приготування стандартного розчину аскорбінової кислоти з концентрацією 2,0 мг/мл.
На аналітичних вагах зважують 0,1000г аскорбінової кислоти з похибкою 0,000025г, переносять у мірну колбу місткістю 50,0 см3 і доводять обсяг до мітки дистильованою водою.
2.2.3 Приготування основного розчину треоніну масової концентрації 1,7026 мг/мл.
Наважку треоніну масою 0,17026г кількісно переносять у мірну колбу місткістю 100,0 см3. У колбу вносять невелику кількість дистильованої води. Вміст колби ретельно перемішують до повного розчинення кристалів треоніну, після чого обсяг в колбі доводять водою до мітки, вміст ретельно перемішують.
. 2.4 Приготування робочого розчину треоніну масової концентрації 0,17026 мг/мл.
У мірну колбу місткістю 100,0 см3 вносять 10,0 см3 основного розчину і доводять обсяг до мітки дистильованою водою. Вміст колби ретельно перемішують.
2.2.5 Приготування фосфатного буферного розчину pH 6,86
У мірну колбу місткістю 1000,0 см3 переносять вміст фіксонала фосфатного буфера з pH 6,86 і доводять об'єм до мітки дистильованою водою.
2.2.6 Приготування розчину 2,6-діхлофеноліндофенолят натрію
Наважку 2,6-діхлофеноліндофенолята масою 0,0625г розчиняють приблизно в 150 см3 гарячої води, попередньо прокип'ячену протягом 30 хвилин, доводять до обсягу 250,0 см3 тієї ж охолодженої водою, перемішують і фільтрують у темну склянку. Розчин зберігають в холодильнику не більше 10 днів [45]
. 3 Оптимізація умов проведення Нінгідринова реакції
Для проведення дослідження в якості досить чутливого методу був обраний спектрофотометрический метод з використанням реакції з нингидрином [46]. Розчини амінокислот, поліпептидів, пептонов і первинних амінів при нагріванні з ннгідріном набувають синю або фіолетове забарвлення. Реакція між нингидрином та зазначеними сполуками протікає складно. Речовини зазнають глибоке перетворення. Припускають, що нингидрин спочатку відновлюється, а амінокислоти окислюються, що супроводжується їх декарбоксилюванням і дезаминированием (малюнок 1). При подальшій взаємодії надлишку нингидрина з відновленим нингидрином і амиак утворюється забарвлений продукт конденсації. Образующееся з'єднання має фіолетово-синє забарвлення (? Max=568нм) і носить назву фіолетовий Руеманна.
Малюнок 1 - Нінгідринова реакція на?-амінокислоти
Незважаючи на широку популярність реакції нингидрина з?-аминокислотам і здавалося детальну її вивченість, окремі аспекти даної реакції зокрема температура, тривалість нагрівання і pH розчину різними авторами трактуються по-різному (таблиця 1).
Таблиця 1 - Умови визначення амінокислот спектрофотометричним методом
Тривалість нагріву, мінутиТемпература нагрівання, 0СрHРеагентЛітературний істочнік25955-62% спиртовий р-р нінгідрінаKhan AA Studies of the kinetics and mechanism of interaction of?-aminoacids with ninhydrin//J. Indian Chem. Soc.- 1989.VOL. 66, № 7. - P. 454-456.151006,42% р-р нингидрина в метілцелозольвеБондаренко Б.Н. Кількісне визначення амінокислот при хроматографії в тонкому шарі/Б.Н. Бондаренко//Лаб. справу.- 1984. - № 2. - С. 118-120.41005,5-6,0спіртовий р-р нінгідрінаКріщенко В.П. Комплексна методика визначення амінокислот у різних фракціях азотного комплексу рослин/В.П. Крищенко//Изв. АН СРСР. Сер. Біологія.- 1978. - № 3. - С. 327-331.301006,41% етаноловий р-р нінгідрінаПоловодова Н.В. Розробка спектрофотометрической методики визначення кислоти аспарагінової на основі реакції з нингидрином/Н.В.Половодова//Молодіжна наука Прикамье - 2002: Тез. докл. Обл. науч. конф. молодих вчених, студентів та аспірантів, Перм, 6-9 грудня 2002 - Перм, 2002. - С. 16210-151006,40,2% розчин нингидрина в етиловому спіртеКалашнікова О.М Визначення амінокислотного складу мікробних матів водних екосистем байкальської ...
