в.
При роботі з робочим реагентом для приготування робочого реагенту слід:
Обережно змішати реагент 1 (Ферментний) і 2 (Субстрат) у співвідношенні 4: 1 Робочий реагент можна зберігати протягом 4-х тижнів при 2-8 0 С і 5 днів при 15-25 0 С.
Досліджуваний матеріал:
Сироватка, ЕДТА- або гепарин-плазма. Гемоліз заважає проведенню аналізу! Втрата активності протягом 3 днів при 4 ° С: lt; 10%, при 20-25 0 С: lt; 17%
Схема проведення аналізу
Довжина хвилі: 340нм або Hg 334 нм, 365 нм
довжина оптичного шляху: 1 см
Температура виміру: 25 ° С, 30 ° С, 37С
Вимірювання: проти повітря (зниження поглинання). Перед вимірюванням реагенти та кювети прогріти до необхідної температури і протягом вимірювання підтримаєивать температуру постійної
(± 0,5 0 С).
Схема піпетування *
Таблиця 10 Метод роботи з індивідуальними реагентами
У кювети піпетіровать25С, 30С37СПроба 200мкл100мклФерментний реагент1000мкл1000мклПеремешать, інкубувати 5 хвилин при необхідній температуреСубстрат250мкл250мклПеремешать, через 1мінуту виміряти поглинання і одночасно включити секундомір. Точно через 1,2,3 хв повторити вимірювання.
Таблиця 11 Метод роботи з робочим реагентом
У кювети піпетіровать25С, 30С37СПроба200мкл100мклРабочій раствор1000мкл1000мклПеремешать, через 1мінуту виміряти поглинання і одночасно включити секундомір. Точно через 1,2,3 хв повторити вимірювання. * Полумикрометодом; для макрометоду обсяги подвоїти
Розрахунок
Розрахувати середню величину зміни поглинання за 1мінуту (А/хв) і використовувати її у розрахунку:
активності АлАТ (од/л)=А/хв х
При зміні поглинання в хвилину (А/хв) 0,06-0,08 (Hg 365нм) або 0,12-0,16 (Hg 334нм і 340нм) слід брати до уваги результати вимірювання тільки в перші 2 хвилини (1 хв інкубувати і 2хв вимірювати). Застосовувати наступні значення фактора F/
Таблиця 12 Метод роботи з індивідуальними реагентами:
Значення фактора FHg334нм340нмHg 365нмF (25С, 30С) 117311512132F (37С) +218421433971
Таблиця 13 Метод роботи з робочим реагентом:
Значення фактора FHg334нм340нмHg 365нмF (25С, 30С) 9719521765F (37С) +178017453235
Фактор перерахунку результатів, виражених у традиційній системі одиниць (Од/л), в Міжнародну систему одиниць (кат/л):
Од/л=16,67 х 10 - 3 мккат/л
мккат/л=60 Од/л
Таблиця 14 Експлуатаційна характеристика
А/мін25С, 30С37СHg 365нм0,080170 Од/л320 Од/лHg334нм/340нм0,160190Ед/л350Ед/л
При такій активності/поглинанні або вище необхідно 0.1 мл проби змішати з 0,9 мл розчину NaCl (0,9%) і повторити визначення, а результат помножити на 10. Високоактивні сироватки можуть показувати очени низькі величини початкового поглинання, так як більша частина НАДН буде витрачена до початку вимірювання. У цьому випадку необхідно провести розведення, як описано вище.
Таблиця 15 Діапазон референтних величин
25С30С37СМужчіниДо 22 Од/ЛДО 30 Од/ЛДО 42 ОД/лЖенщіниДо 17 Од/ЛДО 23 Од/ЛДО 32 Од/л
Контроль якості
Допускається використання контрольних сироваток, активність АлАТ в яких визначена (атестована) даним методом.
Примітка
Ферментний реагент і субстрат містять азид натрію (0,095%). Слід уникати їх контакту зі шкірою та слизовими оболонками!
визначення аспартатамінотрансферази
кінетичний метод
Принцип методу: заснований на послідовності ферментативних реакцій:
- аспартат + 2 - оксоглутарат АЛТ ~ глутамат + оксалоацетат оксалоацетат + НАДН + Н ЛДГ ~ лактат + НАД +
Швидкість зменшення концентрації НАДН, який має максимум поглинання при 340 нм, пропорційна активності АЛТ і вимірюється фотометрически.
Методика аналізу:
Набір реагентів призначений для ручного визначення і для визначення на автоматичних та напівавтоматичних аналізаторах.
Ручне визначення:
Довжина хвилі 340 їм, температура вимірювань 37 С.
У кювету поміщають 500 мкл робочого реагенту, прогрівають 5 хвилин, потім додають 50 мкл досліджувано...
