. Вимірюємо оптичну щільність при 490 нм. (Дивись гафік1)
21) Випала целюлозу суспендованих в 50 мл 0,01 М розчині NaAc, рН 4,5 + 0,05% NaN 3 , що містив 0,1 мл розчину целюлази і інкубували протягом ночі. p> 22) Розчин фільтрували на лійці Шота і осад заново суспезіровалі в новій порції розчину ферменту. Ми отримали фільтрат 2. p> 23) Фільтрат 2 знесолюючих на колонці Sephadex G-25, елюент 0,02% NaN 3 . 0,005 гр. Blue Dextran 2000 кД і 0,250 гр. СоCl 2 розчиняли в 5 мл дісцілірованной води і хроматографіруем. Blue Dextran 2000 кД початок 25 мл кінець 30 мл. СоCl 2 початок 60 мл. кінець 73 мл.
24) Хроматографування на Sepharose CL-4B елюент 0,02% NaN 3 і АсNa 10 mM pH 5,5, поділ за молекулярним масам.
25) Визначаємо кількість цукрів методом Дюбуа (фенольним методом). 200 мкл зразка +200 мкл 5% розчину фенолу, поміщаємо пробірки в холодну воду і додаємо 1 мл. концентрованої сірчаної кислоти. Кип'ятимо на водяній бані 10 хвилин і охолоджуємо. Вимірюємо оптичну щільність при 490 нм (Дивись графік2). p> 2.4 Моносахаридний аналіз
1) Фільтрат 1 і Фільтрат 2 знесолюючих на колонці Sepharose G250, елюент 10мм піридин і 10мм оцтова кислота рН 4,5.
2) Висушуємо при 60 0 С до повної відсутності води.
3) Додаємо 400 мл ТФУ (Тріфторуксусная кислота), поміщаємо в сушильну шафу на 1 годину при температурі 120 0 С.
4) Потім знову сушимо при 60 0 С
5) Розчиняємо водою і визначаємо моносахаридний соcтав на Daionex (Дані моносахаридними складу дивися в таблиці 1).
6) Ми об'єднали наші пробірки в наступні фракції до целлюлазной обробки: фракція 1 5-10; фракція 2 11-16; фракція 3 17-23; фракція 4 24-26; фракція 5 27-35. p> Фракції після целлюлазной обробки: фракція 1 6-10; фракція 2 11-16; фракція 3 17-19; фракція 4 20-24; фракція 5 25-26; фракція 6 27-31.
В
Рисунок 1 - Розподіл прочносвязанной полісахаридів у фракціях після розчинення целюлози до ферментативної обробки.
В
Рисунок 2 - Розподіл прочносвязанной полісахаридів після розчинення після ферментативної обробки
Таблиця 1. Моносахаридний склад у фракціях
рамнозу
арабиноза
Галактоза
Глюкоза
Ксилоза
галактуронова кислота
Глюкуронова кислота
Фракція 1, після целюлази
49.290
33.680
68.173
7.624
5.855
254.246
1.166
...
